斑马鱼研究丨复方中药提取物增强免疫力作用及初步机制研究

发布时间:2022-04-02

近期,无限极(中国)有限公司与环特生物在期刊《中国实验动物学报》上联合发表题为 《复方中药提取物增强免疫力作用及初步机制研究》的全新研究成果。该项目通过体外细胞和体内斑马鱼实验,快速评价复方中药提取物增强免疫力作用,并进行了初步机制研究。

在体外实验中利用 RAW 264.7 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞初步评价复方中药提取物的生物活性;再以酒石酸长春瑞滨诱导建立斑马鱼活体免疫低下模型,分别从斑马鱼巨噬细胞生成和吞噬功能、T 细胞生成及相关炎症、免疫基因的表达等多个方面,观察复方中药提取物的干预作用。

该研究显示,体外实验中复方中药提取物有良好的生物安全性,其在250μg/mL 条件下可提高酒石酸长春瑞滨诱导后的RAW264.7小鼠单核巨噬细胞存活率。体内研究表明,复方中药提取物在222、667、2000 μg/mL 浓度时均可明显改善长春瑞滨诱发的斑马鱼巨噬细胞数量的减少,同时增强巨噬细胞吞噬能力;222、667μg/mL浓度可显著增加 T 细胞荧光强度;222、667、2000μg/mL 浓度均可明显恢复模型对照组中rag1、rag2基因相对表达量被下调的情况,并均可以显著下调模型斑马鱼TNF-α基因相对表达量;复方中药提取物222μg/mL可显著上调免疫因子IL-12基因表达量,在2000μg/mL时显著上调 IFN-γ 基因表达量。

该研究基于体外细胞和体内斑马鱼实验结果表明,复方中药提取物具有明显的增强免疫力作用,为复方中药提取物作为新的免疫保健食品和二次开发提供了指导性依据。

● 综述

免疫力可以保护机体不受侵害,近年来,由于生态失衡所导致的免疫性疾病越来越多,西药不能起到预防作用,治疗效果不甚明显且存在毒副作用。而中药及其提取物在中医药基础理论指导下,擅治未病,讲究协调和平衡,且毒副作用小,所以中药及其提取物增强免疫力一直是新研究方向。

已有实验研究表明,灵芝多糖和生物碱均能明显增强小鼠巨噬细胞吞噬能力和 T 淋巴细胞转化能力,同时可提高小鼠外周血中 IFN-γ 的表达水平。五味子多糖、白术多糖及内酯均具有抗氧化和增强机体免疫力活性;菟丝子提取物是有效的抗菌剂,抗氧化剂和抗炎剂;党参和茯苓在多种急性和慢性炎症的不同实验模型中显示抗炎活性。然而大部分研究都是以传统的大小鼠为动物模型进行评价,具有造模时间长、成本高、通量小等缺点。

斑马鱼(Danio rerio,zebrafish)是一种国际认可的新型模式生物,其引人注目的优势是胚胎发育的透明性,基于高通量的检测体系,以及短时-高效-低费筛选。随着“3R(reduction,replacement,refinement)原则”的推行与实施,其在药物的靶点鉴别、疾病的模型开发和毒性评价中应用越来越广泛。

本研究采用体外细胞实验和体内斑马鱼免疫低下模型探究复方中药提取物对免疫力的影响,从RAW 264.7 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞活性,斑马鱼巨噬细胞数量及其吞噬功能,T 细胞数量,免疫相关基因水平多方面考察复方中药提取物的生物安全性与增强免疫作用,对复方中药提取物增强免疫功能进行验证并提供理论依据。

● 项目研究结果

在体外实验中复方中药提取物有良好的生物安全性,且可明显提高酒石酸长春瑞滨诱导后小鼠单核巨噬细胞的存活率。

体内研究表明,复方中药提取物可明显改善长春瑞滨诱发的斑马鱼巨噬细胞及 T 细胞数量的减少,同时增强体内巨噬细胞的活性和吞噬能力;复方中药提取物可明显恢复模型对照组中rag1、rag2 基因相对表达量被下调的情况,复方中药提取物上调免疫因子 IL-12 的表达量、IFN-γ 基因的相对表达量,复方中药提取物可显著下调 TNF-α 基因相对表达量。

体内、外实验表明复方中药提取物具有明显的增强免疫力作用。综上所述,复方中药提取物具有明显的抗炎及增强免疫力的作用。本研究可为复方中药提取物作为新的免疫保健食品和二次开发提供指导性依据。

● 相关实验

1. 复方中药提取物对RAW264.7细胞存活率的影响

当复方中药提取物浓度为 62.5 ~ 250 μg/mL 时,RAW 264.7 细胞存活率均 > 90.0%;当复方中药提取物浓度为 500 μg/mL 时,RAW 264.7 细胞存活率下降为 84.0%。故确定复方中药提取物对 RAW 264.7 细胞安全浓度为 250 μg/mL(见表 1)。

由表 2 可知,酒石酸长春瑞宾可导致 RAW 264.7 细胞存活率显著下降;同时复方中药提取物 3 倍浓度梯度干预后,细胞存活率呈剂量依赖性升高,复方中药提取物 250 μg/mL 可显著提高 RAW 264.7 细胞存活率(P< 0.01)。

2. 复方中药提取物对斑马鱼的MTC

在实验终点,复方中药提取物62.5~2000μg/mL浓度组斑马鱼均未见明显异常,各脏器和行为状态与正常斑马鱼相似(见图1)。提示复方中药提取物对正常斑马鱼的 MTC为2000μg/mL。

3 复方中药提取物对斑马鱼巨噬细胞生成的影响

由统计结果可知(表3,图2),酒石酸长春瑞宾可导致斑马鱼免疫力低下,表现为与正常对照组比较,酒石酸长春瑞宾组斑马鱼中巨噬细胞荧光强度显著降低;复方中药提取物低、中、高3倍浓度梯度干预后,巨噬细胞荧光强度均显著升高,巨噬细胞减少的改善功效分别为18%(P<0.05)、21%(P<0.01)和 22%(P<0.01)。

4 复方中药提取物对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的影响

由统计结果可知(表4,图3),与模型对照组比较,复方中药提取物低、中、高3个浓度组均可明显减少斑马鱼体内荧光微球残留数目(P< 0.05),表明复方中药提取物具有促巨噬细胞吞噬功能作用。

5 复方中药提取物对斑马鱼T细胞生成的影响

由统计结果可知(表5,图4),与正常对照组比较,模型对照组T细胞荧光强度极显著降低,表明酒石酸长春瑞宾可诱导斑马鱼免疫抑制。与模型对照组比较,复方中药提取物中浓度T细胞荧光强度显著升高(P<0.01);但高浓度对T细胞荧光强度无升高作用且呈现降低的作用趋势。

6 复方中药提取物对斑马鱼 T 细胞的影响及初步机制研究

6.1 RNA 浓度及纯度

在实验终点,提取斑马鱼总RNA,用超微量分光光度计测定RNA浓度及纯度(A260/A280 比值),结果表明 A260/A280 比值均在1.88~2.03之间,表明提取得到斑马鱼总 RNA 质量较好,可用于后续q-PCR实验(见表 6)。

6.2 对重组激活型基因rag1和rag2的影响

根据基因相对表达量公式计算,与正常对照组比较,模型对照组rag1、rag2基因相对表达量均显著下调(P<0.01),复方中药提取物干预后,低、中、高浓度组rag1、rag2基因相对表达量均显著恢复(见表7)。

6.3 对免疫因子IL-12和IFN-γ的影响

与正常对照组比较,模型对照组IL-12基因相对表达量极显著下调(P< 0.001),复方中药提取物干预后,在实验终点,低浓度组IL-12基因相对表达量极显著上升(P< 0.001),中、高浓度组出现负反馈调节。

与正常对照组比较,模型对照组IFN-γ基因相对表达量显著下调(P< 0.01),复方中药提取物3倍浓度梯度干预后,IFN-γ基因相对表达量呈剂量依赖性恢复,复方中药提取物高浓度组 IFN-γ 基因相对表达量极显著上升(P< 0.001)(见表8)。

6.4 对致炎症因子 TNF-α 的影响

模型对照组TNF-α基因相对表达量(1.000)与正常对照组(0.006)比较极显著上调(P< 0.001)。复方中药提取物低、中、高浓度组TNF-α基因相对表达量分别为 0.023、0.002 和 0.008(P<0.001),提示复方中药提取物可显著下调TNF-α基因相对表达量(见表9)。

● 讨论

复方中药提取物是灵芝、五味子、白术、菟丝子、茯苓和党参提取物为主要原料,在之前的研究中,这六味中药提取物均具有增强免疫力相关报道;此外,菟丝子、党参和茯苓在多种急性和慢性炎症模型中显示强抗炎活性。

在本实验条件下,体外细胞实验中当复方中药提取物在62.5~250 μg/mL时,RAW264.7细胞存活率均>90.0%,表明复方中药提取物具有良好的生物安全性,且在巨噬细胞的免疫作用方面,对于降低免疫力的造模剂来说,复方中药提取物也有很好的改善作用,与对照组相比,细胞活性上升,这可能是因为复方中药提取物主要原料的安全性和促进免疫力的作用。例如灵芝多糖可影响免疫细胞和免疫相关细胞,包括促进B和T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞活性。

复方中药提取物同时在本次实验中表现出较好的改善免疫力低下模型中巨噬细胞数量和吞噬能力,以及T细胞的荧光强度,表明复方中药提取物在体内实验中能有效的增强机体免疫力,在之前的报道中,复方中药提取物中具备的灵芝提取物可下调LPS诱导的促炎因子,并促进 BV-2 和原发性小胶质细胞的抗炎细胞因子表达。

另外,灵芝提取物通过改变巨噬细胞吞噬作用从而达到先天免疫应答的激活,对于基因表达水平方面,不同浓度的复方中药提取物对免疫力低下模型抗炎因子水平的恢复,以及致炎因子水平的降低可以很好的从分子机制解释复方中药提取物的增强免疫力的原理,另外相当多的研究对复方中药提取物中的中药成分免疫基因水平的表达给出了很好的解释,例如五味子可通过增加衰老小鼠的血清IL-2,IL-4,IFN-γ,lgG,lgM 和lgA的水平,降低TNF-α和IL-6的含量,并增加白血球数量,吞噬活性,淋巴细胞增殖和体外脾脏指数去增强衰老小鼠的免疫力。

这些研究都为本实验提供了有效的实验依据的支撑,复方中药提取物的增强免疫力功效也均与之报道相符合。