标准解读(一) | 《保健食品功能评价斑马鱼试验规程》团体标准解读!

发布时间:2022-05-07

 

标准背景

近期,国家市场监管总局组织发布了《关于发布〈允许保健食品声称的保健功能目录 非营养素补充剂(2022年版)〉及配套文件的公告(征求意见稿)》,并公开征询意见。该文件对于规范整个保健食品行业具有重大意义,其中配套文件之一《保健食品功能检验与评价方法(2022年版)》包括全部24种保健功能的评价方法,并由强制性方法改为推荐性方法,也积极鼓励功能评价方法创新。

斑马鱼作为一种小型脊椎类模式生物,其实验方法既有体外实验快速、高效的特点,又具备哺乳动物实验相关性好、预测性高的特点。在营养保健食品的研发和评价过程中,斑马鱼实验显示出其独特优势和价值,在原料筛选、配方研发及产品功效评价等方面的应用日渐广泛,取得了显著的科研和产业化成果。

杭州环特生物科技股份有限公司作为斑马鱼技术应用领域的领军企业,成立十余年来已开发出150余种斑马鱼技术模型,申请发明专利64项(已获授权21项),为超过600家客户提供了6000余项实验服务,相关技术成熟稳定,并相继已牵头或参与发布10项团体标准(其中3项为参与发布),有7项新药研究成果也被成功用于CFDA的临床试验申报。

斑马鱼技术,不仅可以助力企业缩短产品研发周期,降低产品研发成本,提升产品质量,从而进一步提高产品市场竞争力,促进行业繁荣发展,而且,为保健食品功能评价提供了一种快速、高效的体内评价方法,能够帮助企业更好地适应保健食品行业消费者需求变化快、产品研发周期短的发展趋势,让保健食品更好地服务于民众健康。

2022年4月15日,由中国保健协会管理归口,杭州环特生物科技股份有限公司牵头,中国标准化研究院、农业农村部食物与营养发展研究所、中国疾病预防控制中心营养与健康所、中国中医科学院中药研究所、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所等22家企业、科研院所共同起草的团体标准——《保健食品功能评价 斑马鱼试验规程》(T/CHC2003-2022)正式发布并实施。

以下就标准的重点内容进行解读——

主要内容及解读

适用范围及解读

标准原文:

本文件规定了斑马鱼用于评价保健食品功能的技术要求,术语和定义、试验流程、受试样品信息确认、斑马鱼准备、试验操作、结果评价及试验报告撰写等内容。

本文件适用于保健食品功能评价斑马鱼试验。

标准解读:

本文件对斑马鱼用于评价保健食品功能(包括具有保健功能的普通食品、保健食品及其原料和配方)的技术要求进行了规定,包括常用术语和定义、试验流程、受试样品信息确认、斑马鱼准备、试验操作、结果评价及试验报告撰写等内容。

本文件适用于普通食品及保健食品的原料筛选、配方研发及产品功能评价的斑马鱼试验。

重点技术内容及解读

1. 斑马鱼准备

标准原文:

1.1 按照GB/T 39649的规定执行斑马鱼质量控制。

1.2 根据保健食品功能选择合适的斑马鱼模型。

1.3 选择发育正常且状态一致的斑马鱼进入试验程序阶段,不同年龄段斑马鱼正常发育状态的典型图见下图:

附录A


 

 

 

标准解读:

1.1 按照GB/T 39649的规定执行斑马鱼质量控制。该国标对实验鱼的种质、遗传、微生物和寄生虫、饲料、环境设施及其监测方法都进行了相关的规定。环特生物目前已获得了实验动物生产与使用许可证、AAALAC国际认证、CNAS及CMA等一系列相关资质认可。

1.2 根据保健功能选择合适的斑马鱼模型。不同保健功能选择的斑马鱼模型不同,造模方式也不一样。选择受精后一定天数的一定品系的斑马鱼,用诱导剂处理一定的时间,建立斑马鱼保健功能评价模型。

举例如下:a)有助于抗氧化功能:推荐用甲萘醌处理受精后3天(3 dpf)的野生型AB品系斑马鱼24 h建立斑马鱼氧化应激模型;

b)润肠通便性能检测:不需要造模;

c)有助于维持血脂健康水平功能:推荐用高糖高脂饲料处理5 dpf的野生型AB品系斑马鱼鱼48 h建立斑马鱼高糖高脂模型;

d)有助于维持血糖健康水平功能:推荐用高糖高脂饲料处理5 dpf的野生型AB品系斑马鱼鱼48 h建立斑马鱼高糖高脂模型。

1.3 不同年龄段的斑马鱼发育状态不同,同一实验条件需要选择斑马鱼选择发育正常且状态一致的斑马鱼进入试验程序阶段,斑马鱼的选取可参照上面的典型图进行。

2. 受试样品前处理

标准原文:

2.1 不同性状受试样品的前处理方法见表1:

 

2.2 受试样品储备液宜用标准稀释水(标准稀释水的配制见附录B)配制,受试样品难以用水溶解时可考虑使用低毒的助溶剂或分散剂。

附录B

 

推荐的溶剂有:二甲基亚砜、乙醇、 甲醇、二甲基甲酰胺、三甘醇。适合的分散剂有:聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐温80、0.01%的纤维素甲醚、聚氧乙烯化氢化蓖麻油。

2.3 储备液配制完成的受试样品应做标识,包括受试样品名称、受试样品浓度、溶剂名称、配制日期、配制人。

标准解读:

受试样品储备液宜用标准稀释水配制,但保健食品的成分较为复杂,很多保健食品中既含有水溶性成分,也含有脂溶性成分,还有一些不溶性成分(如超微粉碎后直接使用的原料粉、益生菌等)。为了让保健食品中的有效成分尽量溶解或均匀分散,有时候不得不使用一些助溶剂,包括有机溶剂和分散剂。本标准推荐使用的都是相关标准中推荐或者有相关科研文献证明其对斑马鱼安全性的助溶剂。推荐的常用有机溶剂包括:二甲基亚砜、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、三甘醇。推荐的分散剂有:聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐温80、0.01%的纤维素甲醚、聚氧乙烯化氢化蓖麻油。

对于助溶剂的使用限量,根据长期积累的数据以及本标准涉及到实验内容的特点,本标准将助溶剂的浓度上限定为1%(W/V或V/V)。1%的浓度上限并不意味着所有助溶剂的终浓度都可以用到1%。在实验溶液配制不受影响的情况下,助溶剂的使用量通常不应超过0.1%。只有当受试样品溶解性确实不好且助溶剂安全性非常好的的情况下,方可将助溶剂的终浓度增加到1%。

如果受试样品不能溶解、乳化或制备成均匀分散的悬浮液,则不适用于本标准的方法。

3. 暴露条件

标准原文:

保健食品功能评价的斑马鱼模型暴露条件如下:

a) 持续时间:通常为4 h-72 h;

b) 更换试验溶液:通常暴露时间在24 h及以内不需要更换溶液。如受试样品富含营养物质,试验溶液容易腐败变质,可考虑换液,换液频率宜根据水质情况调整;

c) 光照:暴露期间避光处理,避免光照对受试样品稳定性的影响;

d) 水温:26~28.5 ℃;

e) 溶解氧:6 mg/L饱和溶解氧;

f) pH:6.8~7.5。

标准解读:

本标准根据国内外斑马鱼相关实验的指南和标准,规定了功能评价实验中对斑马鱼暴露条件的要求。包括:

a)推荐将斑马鱼幼鱼的孵育水温控制在26-28.5℃,温度偏离这个范围的话,斑马鱼的发育会出现明显的延迟或加快;

b)斑马鱼适宜的pH是在6.8-7.5之间,短期内pH5.0-9.0也可以忍受。一旦pH值<5.0或者>9.0,即便是短期内也会对斑马鱼产生严重伤害;

c)溶解氧为不低于6 mg/L饱和溶解氧。24 h及以内不需要更换溶液,如受试样品富含营养物质,试验溶液容易腐败变质,可考虑换液。如果换液无法解决水质恶化的问题,可以考虑加入亚甲基蓝来抑制细菌增长。如果使用亚甲基蓝,亚甲基蓝的浓度应不大于0.1 ppm(即100 μg/L),且所有实验组的亚甲基蓝终浓度应保持一致;

d)每次实验前需要测试一次受试样品溶液的溶解氧和pH,以确保受试样品溶液的溶解氧和pH在正常的范围内,避免水体环境对实验结果的干扰。

4. 确定NOEC(未观察到效应浓度)

标准原文:

实时观察并清除异常的斑马鱼,对斑马鱼的死亡和其它毒性效应进行记录,确定受试样品的NOEC。斑马鱼异常表现如下:

a) 死亡判断标准:静止不动、无心脏跳动、躯干呈白色不透明颜色、对机械刺激无反应。

b) 异常表型:心包水肿、静脉瘀血、血流缺失/减少、出血、脑变性/萎缩/水肿、下颌畸形、眼畸形/水肿、肝脏变性/肿大/萎缩、卵黄囊吸收延迟、肠道发育异常、躯干弯曲/缩短/水肿、肌肉变性、鳔未充气。异常表型的典型图见附录C。

附录C

 

 

c) 异常行为学指标:身体侧翻、游动不协调、游动剧烈和反常的静止。

标准解读:

确定NOEC的目的是为了确定受试样品的浓度设置上限。在本标准的实验方法中,斑马鱼是直接暴露在受试样品溶液中,需要进行预试验来确定受试样品的测试浓度上限。受试样品的浓度上限NOEC的判断依据为:与对照相比,对试验生物未产生显著效应的受试样品浓度,即受试样品处理斑马鱼后未产生死亡、异常表型和异常行为学指标的限高浓度。

根据经验,对于以小分子单体化合物为主要成分的受试样品(如维生素、矿物质),测试浓度上限定为1000 μg/mL;对于成分多样混合物(如天然植物提取物)或分子量<3 KD的大分子化合物的测试浓度上限为2000 μg/mL;对于液体受试样品,需要根据受试样品中的有效成分含量或者可溶性成分浓度来确定测试上限,通常用体积比表示。对于很难溶解或很难均匀分散的受试样品,水溶暴露后很难保证斑马鱼的有效吸收,应考虑对样品必要的前处理或改用水溶暴露以外的其它处理方式。

实施意义

该标准是环特生物携手国内22家权威科研院所、企业发布的国内头个用于食品保健功能检测的完整斑马鱼技术规程,不仅填补了我国食品保健功能检测领域斑马鱼技术规程团体标准的空白,从检测依据、斑马鱼来源和品系等信息、试验条件和方法、试验结果、数据处理与统计方法、推荐参数等关键技术内容进行了充分的实验规范规定及技术创新,其结果适用于保健食品、功能性食品及其原料和配方的功能评价,可操作性、先进性等关键指标均达到了先进水平。

而且,该标准将进一步助力我国斑马鱼技术应用标准体系的完善,全面提升我国斑马鱼技术在保健食品行业功能评价方面的标准化及应用化水平等,对行业具有重要的指导性意义与推动性作用。