斑马鱼研究丨益身清对斑马鱼的肠道蠕动促进作用研究

发布时间:2021-12-06

 

作者:钱星文,谭转换,朱 晨,肖市林,莫志贤,伍小妹

作者单位:东方药林药业有限公司,南方医科大学中医药学院

本文发表于:《中医药导报》2020 年11月第26卷第15期

特别说明:本项目为环特生物客户基于斑马鱼实验模型所作的研究项目,也是国家自然科学基金项目(81673628,81873030)、广州市科技计划项目(201707010287)

● 核心摘要

目的:探讨益身清对斑马鱼肠蠕动的促进作用。

方法:随机选取受精后5 d(5 dpf)野生型AB品系斑 马鱼于培养皿中,用尼罗红喂饲斑马鱼建立肠蠕动模型,分组后药效学组分别给予不同浓度的益身清和多潘立酮,24 h后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并采集数据,以荧光强度的统计学分析结果评价益身清对斑马鱼肠蠕动的促进作用。

结果:益身清不同剂量组(125、250、500、1000、2000 μg/mL)斑马鱼的肠蠕动促进作用分别为25%、45%、49%、62%和66%,与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.001),提示 在本实验浓度条件下益身清对斑马鱼肠蠕动有明显的促进作用。

结论:在本实验浓度条件下,益身清对斑马鱼肠蠕动有明显的促进作用。

● 综述

肠道是人体最大的免疫器官和排毒器官,肠道蠕动能力的强弱在一定程度上影响着肠道的生理功能,与人体的健康息息相关,便秘就是其中一种常见的复杂的临床症状,表现为排便次数少,粪便干硬和(或)排便困难。流行病学研究显示,由于生活条件、饮食结构、生活压力及心理社会等因素影响,便秘的发生率持续升高,但长期使用泻剂来改善便秘,会导致不同程度的副作用,如结肠黑变病,增加患结直肠癌风险等。

因此,寻找天然、有效、不伤肠道的产品治疗便秘显得尤为重要。针对这种现状,东方药林药业有限公司创制了中药健康产品益身清固体饮料,希望通过促进肠道蠕动起到通便的作用, 进而达到缓解便秘的效果,而自产品上市销售以来,收到大量使用反馈,提示通便作用明显。但其药理作用和机制尚不明确。

因此,本实验选择具有经济高效、预测性好、可比度高 等优点的斑马鱼作为实验动物模型,探讨了益身清对胃肠道运动障碍的作用,为了易于观察和统计,实验以尼罗红喂饲斑马鱼建立肠蠕动模型,以荧光强度数据作为观察指标,研究益身清对斑马鱼肠蠕动的促进作用,进而证明益身清的通便作用,并为斑马鱼肠道运动障碍评价乃至食品成分生物活性的研究奠定理论基础,为产品在缓解便秘方面的应用提供安全、有效的依据。

● 实验方法

1. 造模

利用斑马鱼卵暴露于尼罗红溶液中,富含脂肪的组织卵黄囊与之结合,当斑马鱼发育到5~6d时,大部分尼罗红被卵黄囊吸收,在荧光显微镜下可以清晰观察到肠道中尼罗红的充盈情况,说明斑马鱼肠蠕动模型建立。

2. 实验给药

2.1 最大耐受浓度(MTC)剂量实验组

随机选取180尾受精后6d(6spf)模型斑马鱼于六孔板中,每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼,养殖用水养殖,分别给予益身清250、500、1000、1500和2000μg/mL浓度的水溶液,同时设置正常对照组(养鱼 用水处理斑马鱼),每孔(实验组)加入3mL。益身清处理24 h后,观察记录斑马鱼的表型和死亡情况,确定益身清对斑马鱼的MTC。

2.2 益身清对斑马鱼肠蠕动促进作用药效组

正常对照组:养鱼用水处理模型斑马鱼;

阳性对照组:多潘立酮30μg/mL;

实验1组:益身清125 μg/mL;

实验2组:益身清250 μg/mL;

实验3组:益身清500 μg/mL;

实验4组:益身清1000 μg/mL;

实验5 组:益身清2000 μg/mL。

2.3 观察指标

记录最大耐受浓度(MTC)剂量实验组各组斑马鱼的表型和死亡情况,用以分析本实验不同剂量对斑马鱼的安全性;药效各组分别给予相应的药物,24h后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并采集斑马鱼肠道内容物(尼罗红)荧光强度数据,用以观察斑马鱼肠蠕动情况。

用NIS-Elements D3.10高级图像处理软件进行图像分析,计算斑马鱼肠道内容物(尼罗红)荧光强度(S),并进行分析统计,以荧光强度的统计学分析结果评价益身清对斑马鱼肠蠕动的促进作用。益身清对斑马鱼肠蠕动的促进作用计算公式如下:

● 实验结果

1. 最大耐受浓度(MTC)测定

益身清在250~2000μg/mL浓度下,对斑马鱼未产生任何明显的毒副作用,也未引起死亡,故确定益身清对斑马鱼的MTC为2000 μg/mL(此浓度为最大耐受浓度检测上限)。(见表1)

2、益身清对斑马鱼肠蠕动促进作用评价

阳性对照药多潘立酮30μg/mL浓度组斑马鱼肠道内容物(尼罗红)荧光 强度总和低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.001),其 对斑马鱼肠蠕动促进作用为43%,说明多潘立酮对斑马鱼肠蠕动有明显的促进作用。益身清125、250、500、1000和2000μg/mL浓度组斑马鱼肠道内容物(尼罗红)荧光强度总和低于正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.001),提示益身清在本实验浓度条件下对斑马鱼肠蠕动有明显的促进作用。(见表2、图1~2)

● 讨论

斑马鱼模型用于新药筛选,始于20世纪90年代,如今已成为继大鼠和小鼠之后的第三大模式生物,被广泛应用于药物筛选和药物安全性评价当中。

国际斑马鱼模式生物数据库(ZFIN)中注册的斑马鱼实验室多达1304个,我国仅斑马鱼生产和使用单位就有300多家,在与胃肠道方面相关的斑马鱼实验有如益生菌对嗜水气单胞菌感染斑马鱼模型肠道黏膜免疫的保护作用研究、根据斑马鱼模型的荧光强度和肠道蠕动促进作用对菌株其进行筛选、基于斑马鱼模型的低聚果糖和低聚异麦芽糖对肠道蠕动促进作用的研究等。

在目前采用斑马鱼进行功效及机制评价的研究多集中于食物提取物或者益生菌,对食品全组分功效学研究筛选的报道较少的情况下,本研究利用临床常用的具有促进肠蠕动作用的多潘立酮作为新型模式生物斑马鱼实验的阳性对照药物进行食品全组分的功效学研究,实验结果与预想结果、传统动物模型的相关实验结果一致,亦为阳性;但耗费的时间更短、成本更少、操作更简便、结果更易于观察。

这就为斑马鱼模型在食品全组分的肠道蠕动药效学方面的筛选应用和功效评估提供了有利参考,为胃肠道运动障碍药物的动力学评价试验、功能食品的开发提供了平价、快速、行之有效的 方法和有用工具。

本实验产品由低聚果糖、菊粉、阿拉伯胶、白茅根、菊花、柳橙水果粉、草莓蓝莓混合果粉、梨果仙人掌果汁粉等天然植物食品原料组成;配方以益生元低聚果糖、菊粉代替传统食糖,不参与机体糖代谢、无负担;菊花和白茅根是我国传统药食同源中药材,在方中起到清热、抗炎的作用;低聚果糖、菊粉、梨果仙人掌果汁粉均为新食品原料,阿拉伯胶 是常用的多糖类食品添加剂,柳橙水果粉、草莓蓝莓混合果 粉是常见水果的果汁粉末。在本实验条件下,益身清组斑马鱼的肠道蠕动促进作用与正常对照组比较,差异均有统计学意 义(P<0.001),提示在本实验浓度条件下益身清对斑马鱼肠蠕动有明显的促进作用,达到了预期的通便效果。

综上所述,益身清产品能通过促进斑马鱼肠蠕动从而达到通便的功能,其机制可能与益身清能促进斑马鱼肠道蠕动能力有关。而本实验也存在一定的不足和局限性,如益身清产品在便秘方面的具体作用机制还需要通过建立斑马鱼便秘模型进行更进一步的研究,而在以斑马鱼作为实验动物的 过程中,还不能明确的观察到产品对斑马鱼是否有产生胃肠道胀气、肠鸣等不良反应,因此这可能还需要结合哺乳动物实验及人体试验提供更可靠、有效的研究体系。