斑马鱼研究丨二十五味肺病丸改善斑马鱼微血管功能障碍及机制的探究

发布时间:2022-01-18

作者:强巴,郭胜亚,陈伦举,徐懿乔,李峰

本文发表于:《天津中医药大学学报》2021年12月第40卷第6期

作者单位:西藏奇正藏药股份有限公司,杭州环特生物科技股份有限公司,本项目为国家新药创制科技重大专项基金项目(2017ZX 09031059)。

核心摘要

目的:观察二十五味肺病丸是否能够改善微血管功能障碍并探究其潜在机制。 

方法:利用花生四烯酸诱 导建立斑马鱼血栓模型,检测二十五味肺病丸给药组和对照组斑马鱼心输出量和血流速度;用辛伐他汀诱导建立 斑马鱼微血管缺失模型,计算斑马鱼肠下血管面积和斑马鱼体节间血管直径;给予普纳替尼诱发斑马鱼血管内皮 损伤模型,观察尾静脉血栓形成情况,以评价二十五味肺病丸对微血管功能的影响。

结果:与对照组相比,二十五味 肺病丸给药组(27.8 mg/L)心输出量显著性增加(0.11 vs 0.19 nL/s,P<0.05),血流速度显著增加(398 vs 693 μm/s,P< 0.001),肠下血管面积增加(19 335 vs 25 041 像素,P<0.05),微血管再生促进作用增强;同样,给予二十五味肺病丸 处理后(83 和 250 μg/mL),斑马鱼节间血管直径明显增大(8.7 vs 11.5 vs 11.8 像素,P<0.001),血栓发生率显著下降。 

结论:二十五味肺病丸可以改善微血管功能障碍,其可能是通过改善微血管血流动力学作用,减少血管内皮损伤,促进内皮再生和减少血栓生成实现。

● 综述

1954年第一届国际微循环会议正式提出了“微循环”这一概念,是指微动脉和微静脉之间的血液循环。健全的微循环功能是机体正常运转的重要前提。微血管的结构、形态、功能和血流动力学的破坏如血栓、血管内皮受损、心输出量病理性减少等危险因素发生时,可导致微循环功能障碍,造成各器官组织营养物质和氧气供应减少,代谢废物的积累,引起细胞损伤和器官功能异常,严重者可危及生命。

大量研究表明,微血管的功能异常导致的微循环功能障碍与肥胖、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病等密切相关。二十五味肺病丸是始载于《四部医典》的经典名方,其主要成分为獐牙菜、红花、檀香、牛黄、悬钩木、沙棘膏、诃子等25味药材,是传统藏药理论与现代制药技术相结合研发出的新型藏药,药物性质更加稳定,具有口服顺应性好,生物利用度高的特点。主要用于各种肺病引起的咳嗽,胸胁痛,呼吸急促等呼吸道疾病。

有研究表明,二十五味肺病丸能够促进巨噬细胞吞噬功能、增强肠道蠕动等作用。二十五味肺病丸中含有红花等具有止血、养血、促进新组织再生的成分,并且能够全面消除肺部毒素,修复呼吸道损伤,因此在肺部炎症改善方面有较好的疗效,考虑到心血管系统尤其是微循环在改善炎症和组织新生中的关键作用,推测二十五味肺病丸是否参与改善微血管功能。

本研究发现,二十五味肺病丸能够增加血栓斑马鱼心输出量和血流速度,改善斑马鱼辛伐他汀诱发的微血管缺失,促进微血管再生,并且能够减少内皮细胞的损伤,降低血栓的发生率,为二十五味肺病丸的临床应用提供了药理学依据。

● 实验方法

1. 斑马鱼血栓模型及检测

随机选取180尾受精后3天(3dpf)的野生型 AB 系斑马鱼置于六孔板中(30尾/孔)。正常对照组给予溶剂对照,阳性对照组给予阿司匹林(25mg/L);给药组给予二十五味肺病丸27.8、83.3和250μg/mL,其后除正常对照组外其余各组给予花生四烯酸干预1h 建立血栓模型,每组随机取10尾斑马鱼置于心跳血流分析系统下 录制斑马鱼血流视频,分析统计斑马鱼心输出量(O)和血流速度(V),评价心输出量增加作用和血流 速度增加作用,以心输出量和血流速度的统计学意义分别评价其对花生四烯酸诱导血栓模型斑马鱼血流动力学的改善作用。

其微血管血流动力学改善作用计算公式如下:

2. 微血管缺失模型及检测

随机选取180尾受精后24h的转基因血管荧光斑马鱼,置于六孔板中 (30 尾/孔)。正常对照组给予溶剂对照,模型组给予辛伐他汀(25 mg/mL)处理后,阳性对照组给予黄芪甲苷(23.5 μg/mL),药物组给予二十五味肺病丸27.8、83.3和250μg/mL,处理2天后,每组随机取 10 条斑马鱼在荧光显微镜下观察斑马鱼肠下血管、拍照并保存图片。通过图像分析,计算斑马鱼肠下血管面积(S),以肠下血管面积的统计学意义评价药物 对辛伐他汀诱发的斑马鱼微血管缺失的再生作用。

对斑马鱼微血管缺失的再生作用计算公式如下:

3. 斑马鱼血管内皮损伤模型及检测

随机选取180尾5dpf转基因血管荧光斑马鱼(30 尾/孔)。正常对照组给予溶剂对照,模型组给予普纳替尼处理后,阳性对照组给予阿司匹林(45μg/mL),药物组给 予二十五味肺病丸27.8、83.3和250μg/mL,24 h 后 每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并采集数据,拍照部位统一选取泄殖孔上方对应的三根血管,通过图像分析,计算斑马鱼体节间血管直径(D)。以体节间血管直径的统计学意义评价不同药物对普纳替尼诱发的斑马鱼血管内皮损伤的保护作用。

对斑马鱼血管内皮损伤(直径减小)的保护作用计算公式如下:

观察记录血栓发生尾数,计算各组斑马鱼血栓发生率(%),以血栓发生率评价不同药物诱发的血管内皮损伤所致血栓的保护作用。

● 实验结果

1. 确定斑马鱼对二十五味肺病丸的最大耐受浓度

斑马鱼血栓建模成功后,给予不同浓度的二十五味肺病丸,观察斑马鱼的死亡情况。二十五味肺病丸浓度为125和250μg/mL时,斑马鱼未产生任何明显的不良反应,也未引起斑马鱼死亡,在500和1000μg/mL浓度下均诱发100%(30/30)斑马鱼心率和血流减慢,在1500、2000 μg/mL浓度下分别诱发 26.7%(8/30)和100%(30/30)斑马鱼死亡(见表1)。因此确定血栓模型斑马鱼对二十五味肺病丸的最大耐受浓度为 250μg/mL。

表1 二十五味肺病丸处理后浓度-致死性

2、二十五味肺病丸改善斑马鱼微循环血流动力学

与正常对照组(0.36 nL/s)相比,模型对照组斑马鱼心输出量(0.11 nL/s)显著下降,提示模型建立成功。与模型对照组相比,阳性对照药阿司匹林25μg/mL浓度组、二十五味肺病丸27.8μg/mL浓度组斑马鱼心输出量明显增加(0.11vs 0.30nL/s,P<0.001;0.11vs0.19 nL/s,P<0.05),心输出量增加作用为76%和32%。

通过进一步检测二十五味肺病丸对血栓斑马鱼模型的血流速度的作用,与模型对照组相比,阳性对照药阿司匹林25μg/mL浓度组、二十五味肺病丸27.8和83.3μg/mL浓度组斑马鱼心输出量明显增加(398vs978 μm/s,P<0.001;398vs693μm/s,P<0.001;398vs594μm/s,P<0.05),血流速度增加百分比分别为74%、37%和25%,以上结果提示二十五味肺病丸能够增加血栓斑马鱼心输出量,加快血流速度,改善微循环血流动力学,见表2。

3、二十五味肺病丸促进微血管再生

确定该模型中二十五味肺病丸的最大耐受浓度后,进一步检测了二十五味肺病丸对微血管再生的影响。与正常组比较,微血管缺失模型组肠下血管面积明显减少(P<0.001)。

与模型对照组相比,二十五味肺病丸浓度为0.11μg/mL、0.33μg/mL和1μg/mL组斑马鱼肠下血管面积显著升高(P<0.001),对微血管再生的促进作用分别为75%、78%和91%(P<0.001,见图1、表3)。以上结果提示二十五味肺病丸能够改善微血管损伤,促进微血管的再生。

4、二十五味肺病丸改善血管内皮损伤

确定最大耐受浓度和建模成功后,进一步检测各组斑马鱼节间血管直径和血栓形成情况。与模型组相比,二十五味肺病丸0.11、0.33和 1μg/mL组节间血管直径分别为10.2、11.5和11.8像素,对血管内皮的保护作用分别为29%、56%和61%(P>0.05、P<0.001、P<0.001,见表 4);

同样,与模型组血栓发生率(87%)相比,浓度为28、83和250 μg/mL的二十五味肺病丸斑马鱼血栓发生率分别为73%、50%和33%,与模型对照组比较,各组P>0.05、P<0.01、P<0.001(见表5)。

以上结果提示二十五味肺病丸能够对斑马鱼血管内皮损伤具有保护作用。

● 讨论

正常的微循环功能是保证体内重要脏器维持正常功能的重要前提,微血管的形态、结构,以及血流动力学的完整性是保障微循环功能正常的重要 条件。在血管内皮细胞受损、心输出量病理性减少、 血栓发生等危险因素发生时,微循环严重受损,直接危害机体健康。

大量研究表明微血管功能障 碍诱发微循环功能失调,是高血压、肥胖和糖尿病 及许多神经系统、心脑血管等疾病的重要发病因素。目前关于改善微循环的药物多样,治疗效果参差不齐,不良反应明显,总体而言效果不尽人意, 寻找新的靶向微循环功能改善的药物迫在眉睫。

二十五味肺病丸是始载于《四部医典》的经典明方,其主要成分为獐牙菜、红花、檀香、牛黄、悬钩木、沙棘膏、诃子等25味药材,其中红花、牛黄等主要成分已经被证明能够增强心肌兴奋性、促进血液循环等改善心血管功能的效用,并且二十五味肺病丸对肺部炎症有较好的疗效,局部微循环的功能和炎症改善息息相关,因此二十五味肺病丸能否改善微循环功能障碍值得探究。

本研究选用了斑马鱼作为模式动物模型,探讨了二十五味肺病丸在斑马鱼花生四烯酸诱导的血栓模型、普纳替尼以及辛伐他汀诱导的微血管损伤模型和血管内皮损伤模型中的作用,结果发现二十五味肺病丸首先能够改善微循环血流动力学,实验结果发现二十五味肺病 丸能够增加斑马鱼 25%的血流速度,最大增加32%血栓斑马鱼的心输出量,这表明二十五味肺病丸能够通过调节心肌收缩能力,促进心脏泵血,从而增加微血管血压,保障微循环充盈压,有助于改善病 变局部的物质交换。

炎症发生时,组织局部的脉管 系统常常受损,因此微循环血管损伤的改善和血管 新生在改善炎症中起到重要作用,二十五味肺病丸组斑马鱼节间血管直径明显增大,表明二十五味肺病丸能够有效地保护斑马鱼节间血管,减少血管内皮损伤,并且二十五味肺病丸斑马鱼肠下血管面积显著增加,提示二十五味肺病丸促进了斑马鱼血管的新生。

因此,二十五味肺病丸能够改善微循环血流动力学,促进组织局部的物质交换,并且减少微血管内皮损伤,促进微血管新生,极大限度地保障了微血管功能的行使,进而减少血栓生成,起到改 善微循环并促进其恢复功能的作用。

综上所述,二十五味肺病丸可以显著减少血管内皮损伤,促进其再生,改善微血管血流动力学作用,减少血栓生成,改善微血管功能障碍。二十五味肺病丸改善微血管功能的研究发现为其在临床上 微循环功能障碍性疾病中的应用提供了药理基础, 也为临床治疗微循环功能障碍提供了潜在的治疗药物。但考虑斑马鱼非哺乳动物,其具体药效和详细的分子机制有待在哺乳动物中进行进一步验证。