利用兔眼角膜上皮细胞评价供试品是否具有眼刺激性

【评价原理】

化合物直接作用于角膜引起的刺激作用类似于细胞毒性损伤作用，通过检测细胞毒性指标，可反映角膜损伤的程度。试验采用体外培养的兔角膜上皮细胞（SIRC），短时暴露于供试品，模拟急性角膜刺激作用，通过计算细胞相对存活率来预测供试品引起的眼睛损伤。

【实验方案】

取稳定生长状态的细胞,调整细胞浓度为3×104/mL，按每孔200µL细胞悬液接种于96孔板（6000个细胞/孔）中（除最外周孔）。设置空白对照、培养基对照、溶剂对照、阳性对照组和供试品组。放人二氧化碳培养箱中常规条件培养48h。换液，去除完全培养基，PBS清2次，加新鲜完全培养基，培养24h。待上述培养的细胞融合度达80%以上时暴露于200μL5%和0.05%供试品溶液中，染毒5min，每个样品做3个复孔，同时将做相应的处理。染毒结束，用200μL磷酸盐缓冲液冲洗2次。

然后每孔中加入200μLMTT（0.5mg/mL）溶液，放入37℃ 5%CO2培养箱中培养2h，倒出MTT溶液，加入200μL0.04N酸化异丙醇作用60min提取MTT甲瓒（室温暗室中操作），然后在多功能酶标仪中测定570nm处吸光度值(OD570值)。根据OD值计算细胞存活率。

每个样品需重复三次试验。当5%和0.05%浓度的受试物的细胞存活率均大于70%时，则判断该受试物眼刺激强度为无刺激性或微刺激性；当5%和0.05%浓度的受试物的细胞存活率均≤70%时，则判断该受试物眼刺激强度为腐蚀性(不可逆眼损伤)；若受试物0.05%浓度溶液的细胞存活率大于70%，而5%浓度溶液的细胞存活率≤70%时，则需加做其他试验加以判定。

【评价指标】

细胞存活率

【结果展示】

1、供试品刺激反应分级表

【评价结论】

1、供试品1在5%和0.05%浓度的细胞存活率均≤70%时，则判断该受试物眼刺激强度为腐蚀性(不可逆眼损伤)；供试品2在5%和0.05%浓度的细胞存活率均大于70%时，则判断该供试品眼刺激强度为无刺激性或微刺激性。

参考文献：

[1] 化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验Short Time Exposure In Vitro Test Method (STE)