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【评价原理】
化合物直接作用于角膜引起的刺激作用类似于细胞毒性损伤作用,通过检测细胞毒性指标,可反映角膜损伤的程度。试验采用体外培养的兔角膜上皮细胞(SIRC),短时暴露于供试品,模拟急性角膜刺激作用,通过计算细胞相对存活率来预测供试品引起的眼睛损伤。
【实验方案】
取稳定生长状态的细胞,调整细胞浓度为3×104/mL,按每孔200µL细胞悬液接种于96孔板(6000个细胞/孔)中(除最外周孔)。设置空白对照、培养基对照、溶剂对照、阳性对照组和供试品组。放人二氧化碳培养箱中常规条件培养48h。换液,去除完全培养基,PBS清2次,加新鲜完全培养基,培养24h。待上述培养的细胞融合度达80%以上时暴露于200μL5%和0.05%供试品溶液中,染毒5min,每个样品做3个复孔,同时将做相应的处理。染毒结束,用200μL磷酸盐缓冲液冲洗2次。
然后每孔中加入200μLMTT(0.5mg/mL)溶液,放入37℃ 5%CO2培养箱中培养2h,倒出MTT溶液,加入200μL0.04N酸化异丙醇作用60min提取MTT甲瓒(室温暗室中操作),然后在多功能酶标仪中测定570nm处吸光度值(OD570值)。根据OD值计算细胞存活率。
每个样品需重复三次试验。当5%和0.05%浓度的受试物的细胞存活率均大于70%时,则判断该受试物眼刺激强度为无刺激性或微刺激性;当5%和0.05%浓度的受试物的细胞存活率均≤70%时,则判断该受试物眼刺激强度为腐蚀性(不可逆眼损伤);若受试物0.05%浓度溶液的细胞存活率大于70%,而5%浓度溶液的细胞存活率≤70%时,则需加做其他试验加以判定。
【评价指标】
细胞存活率
【结果展示】
1、供试品刺激反应分级表
【评价结论】
1、供试品1在5%和0.05%浓度的细胞存活率均≤70%时,则判断该受试物眼刺激强度为腐蚀性(不可逆眼损伤);供试品2在5%和0.05%浓度的细胞存活率均大于70%时,则判断该供试品眼刺激强度为无刺激性或微刺激性。
参考文献:
[1] 化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验Short Time Exposure In Vitro Test Method (STE)
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