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1、实验原理
细胞衰老（cellular senescence）是细胞在应激（如端粒缩短、DNA损伤、氧化应激等）下进入的一种不可逆增殖停滞状态，但其代谢活性仍部分保留。衰老细胞会分泌大量炎症因子、趋化因子、基质重塑酶等，形成致病性衰老相关分泌表型（SASP），是衰老影响周围组织的核心机制，该表型可驱动继发性衰老并破坏组织稳态，导致组织修复和再生丧失。细胞衰老标志物是指在细胞衰老过程中出现的特征性变化，这些标志物可以用于检测和研究细胞衰老。包括：1）原发性标志：基因组不稳定性、端粒缩短、表观遗传改变、蛋白质稳态失衡；2）拮抗性标志：自噬功能障碍、营养感应失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞耗竭；3）整合型标志：细胞间通讯改变、慢性炎症、菌群失调、细胞外基质变化和心理社会隔离。这些标志相互关联，共同推动了衰老的进程。
图1.衰老的14个特征及其在原发性、拮抗剂和综合性衰老过程中的作用的示意性概述
1）基因组不稳定性：DNA损伤增加且修复能力下降，导致基因突变和染色体异常，进而引发细胞功能障碍和疾病，标志物γ-H2AX；
2）端粒磨损：端粒会随着细胞分裂逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度时，细胞就会失去分裂能力，标志物端粒长度、端粒相关蛋白（如TRF2）；
3）表观遗传改变：表观遗传改变是指基因表达调控机制发生变化，影响基因的表达和功能，标志物DNA甲基化（DNMT1）、组蛋白修饰；
4）蛋白质稳态丧失：蛋白质折叠、修饰和降解等过程失调，导致蛋白质聚集和功能异常，标志物蛋白质聚集（如泛素化蛋白聚集）、分子伴侣蛋白（如HSP70）；
5）细胞自噬失能：细胞自噬是清除受损细胞器和蛋白质的重要机制，其功能下降会导致细胞内废物积累，标志物自噬相关蛋白（如LC3-II/LC3-I比值）；
6）营养感应失调：细胞对营养物质的感应和代谢调节能力下降，影响能量代谢和细胞功能，标志物胰岛素/IGF-1信号通路相关蛋白（如AKT、mTOR）、AMPK活性；
7）线粒体功能障碍：线粒体的能量代谢功能下降，导致能量代谢异常和细胞损伤，标志物线粒体膜电位（如JC-1荧光探针）、线粒体DNA损伤；
8）细胞衰老：细胞进入不可逆的生长停滞状态，但不会死亡，还会释放炎症因子，标志物β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性、p16INK4a和p21CIP1蛋白表达；
9）干细胞耗竭：干细胞数量减少、功能下降，导致组织和器官的修复能力减弱，标志物干细胞标志物（如CD34、CD133）、干细胞数量（通过流式细胞术检测）；
10）细胞间通讯改变：细胞间的信号传导和相互作用发生改变，影响组织和器官的功能；标志物细胞因子（如IL-6、TNF-α）、细胞外囊泡（如外泌体）；
11）慢性炎症：低度慢性炎症状态持续存在，导致组织损伤和疾病发生，标志物白细胞介素-6（IL-6）；
12）菌群失调：肠道微生物群落失衡，影响免疫系统和代谢功能，标志物肠道菌群组成（通过16S rRNA测序）、短链脂肪酸（如乙酸、丙酸）；
13）细胞外基质变化：细胞外基质的成分和结构发生改变，影响细胞的微环境和功能，标志物胶原蛋白和弹性纤维含量、基质金属蛋白酶（MMPs）活性；
14）心理-社会隔离：社会交往减少、心理压力增加等心理社会因素对衰老产生影响，标志物心理压力标志物（如皮质醇水平）、社会支持评估问卷。
本实验拟利用人永生化角质形成细胞/人真皮成纤维细胞等构建实验模型，通过检测相关衰老标志物的表达，多维度评价样品是否具有抗衰老作用。
2、检测项目
3.检测流程
4.部分结果展示
图1.P21基因相对表达量柱形图
与模型对照组比，*p<0.05，***p<0.001
图2.P53基因相对表达量柱形图
与模型对照组比，*p<0.05，***p<0.001
图3.线粒体膜电位红色/绿色荧光典型图
图4.线粒体ROS典型图
图5.γ-H2AX典型图
图6.P16蛋白表达典型图
5.结果描述
根据测试结果，与正常对照组比，模型对照组的JC-1红色荧光/绿色荧光比值显著下调，线粒体ROS平均荧光强度显著上调，γ-H2AX平均荧光强度显著上调，p16蛋白表达显著上调，P53和P21基因相对表达量显著上调，说明本次刺激有效；
与模型对照组比，阳性对照组的JC-1红色荧光/绿色荧光比值显著上调，线粒体ROS平均荧光强度显著下调，γ-H2AX平均荧光强度显著下调，p16蛋白表达显著下调，P53和P21基因相对表达量显著下调，说明本实验有效且可靠。
6.参考文献
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