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1、实验原理
毛乳头细胞是毛囊微环境的核心组成部分，对毛囊的形成、周期维持、干细胞活性调节、血管生成和免疫调节等过程起着至关重要的作用，受多种信号通路的精确调控，包括Wnt/β-catenin、TGF-β/BMP-Smad、Notch、Hedgehog（HH）和PI3K/AKT信号通路。这些信号通路相互作用形成复杂的调控网络，共同调节毛囊发生发育的机制。
1）Wnt/β-catenin信号通路：Wnt/β-catenin信号通路被认为是毛囊从静止期转化到生长期的中心信号通路，它参与毛囊发育的各个阶段，决定细胞在发育过程中的分化命运，它的主要核心成员是β-catenin，它在调节细胞行为中起着关键作用，是维持毛囊生长过程中所必需的。当Wnt信号失活时，APC、Axin和GSK3形成多蛋白复合物，可靶向并磷酸化β-catenin，导致细胞质β-catenin过度降解。当Wnt信号被激活时，Wnt蛋白与卷曲受体和脂蛋白受体相关蛋白5/6（LRP5/6）相互作用，激活的受体复合物就会诱导某些关键成分的募集，例如Dvl，从而导致破坏复合物被解体，恢复β-catenin的活性，使β-catenin积累并与淋巴增强因子/T细胞因子（LEF/TCF）转录因子一起进入细胞核，调节靶基因转录，从而促进HFSCs的激活、增殖和定向分化。
2）TGF-β/BMP-Smad信号通路：TGF-β超家族由40多种配体组成，根据结构和功能可将其分为TGF-β亚家族、骨形态发生蛋白（BMP）亚家族、激活素（activin）／抑制素（inhib-in）亚家族等几大类，均为具有多效性的细胞因子，参与调节多种多样的生物学反应。Smad蛋白是在脊椎动物、昆虫和线虫体内发现的转录因子家族，分为3类，分别为受体活化型（R-Smad）、共同介质型（Co-Smad）和受体抑制型（I-Smad）。受体活化型包括Smad1／2／3／5／8；共同介质型有Smad4；受体抑制型有Smad6／Smad7。在BMP途径启动时，BMP二聚体与特定受体连接，二聚体磷酸化并激活R-Smad，随后与Co-Smad结合。最后，R-Smad/co-Smad形成的复合物被易位到细胞核中，导致其靶基因反式激活。通过BMP信号通路参与毛囊的生长，调控HFSCs的增殖和分化。
3）Notch信号通路：Notch信号通路是一种高度保守的信号通路，通过细胞间相互作用调节生物体的生长发育，并参与各种皮肤细胞的增殖和分化，Notch胞外结构域与细胞配体结合，然后被蛋白酶γ-分泌酶水解后，Notch受体蛋白被切割3次，释放Notch细胞内结构域（NICD），然后被转运到细胞核，在那里它与DNA结合，激活靶基因的转录，如毛状和分裂增强子（Hes）、矮小转录因子（Runx）和Notch抑制膜蛋白（Numb），然后激活Wnt/β-连环蛋白信号传导的下游途径，发挥一系列生物学效应。
4）Hedgehog（HH）信号通路：HH通路是表皮和间充质之间信号转导的重要通路，它可以促进表皮和毛囊的发育，修复损伤并维持毛囊隆起干细胞的特征。它可以调控胚胎毛囊发育过程中N-Myc和细胞周期蛋白D2的表达，并与Wnt/β-catenin信号通路合作参与成熟毛囊发育。经典的HH信号通路转导过程通常涉及以下关键成分：① HH配体，② 细胞表面受体贴片（Ptch），③ 膜蛋白平滑（Smo），④ 转录因子神经胶质瘤（Gli）和⑤ 融合蛋白抑制因子（SuFu）。在没有HH的情况下，SuFu与Gli结合以防止Gli进入细胞核并被降解。当HH信号被激活时，SuFu-Gli-2复合物解离，Gli-2被激活。膜蛋白Smo通过GPCR依赖性和非依赖性途径激活Gli转录因子，使Gli转录因子转移到细胞核并激活多个细胞信号靶基因的转录，包括HH信号通路成分（Ptch、Gli-1）和超家族蛋白（Wnt、TGF）。当编码SHH下游转录因子SOX9的基因失活时，外伤后的表皮修复受到抑制，HFSC失去了其生态位微环境，无法再迁移和增殖以维持毛囊周期。
5）PI3K/AKT信号通路：是参与调节细胞生长、增殖和分化的重要信号转导途径，PIP3与PI3K依赖性激酶1（PDK1）结合，后者可以磷酸化Akt蛋白上的Thr308，从而激活AKT。PI3K依赖性激酶2（PDK2）可以磷酸化AKT蛋白上的Ser473，也可以激活AKT。然后，激活的AKT通过激活或抑制相关的下游分子（mTORC、GSK3、FOXO）等）,对下游靶蛋白产生重要影响。磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）是一种抑癌基因。其主要功能是使PIP3去磷酸化，并将其转化为细胞质中的磷脂酰肌醇4,5-三磷酸（PIP2），以抑制PI3K/AKT通路的激活。表皮或HFSC损伤后，激活的AKT磷酸化显著增加，毛囊细胞周期上调。PI3K/AKT信号通路可以促进毛囊从休止期到生长期早期的转化，诱导毛囊间表皮干细胞和HFSCs的增殖，通过释放相关分子（如细胞因子和生长因子）进一步激活PI3K/AKT信号通路，促进毛囊再生，加速创面愈合。
6）Notch1信号系统参与确定HFSC是否分化为毛囊或表皮线，SHH信号通路是β-连环蛋白活性所必需的，各种信号通路之间的相互作用形成了一个微调的调控网络。经典的Wnt信号通路位于HH信号传导的上游，在皮肤发育过程中，β-连环蛋白激活诱导表皮中SHH的表达，Wnt/β-连环蛋白信号通路通过HH和BMP信号通路调节HFSC的命运。此外，免疫相关的AKT/β-catenin信号通路在HFSCs中起关键作用，促进HF循环和创伤后再生，这些大而复杂的信号通路的精确调控有效地控制了HFSCs的增殖和分化。
脱发，是指头发脱落的一种生理现象，分为生理性脱发和病理性脱发。一般说来，一个健康的人平均每天都会脱落50~100根头发，属于正常的新陈代谢，日常的洗头和梳头都会引起少部分头发的掉落，掉发和生发整体数量保持动态平衡，这称为生理性脱发。病理性脱发一般分为三种类型：雄激素性脱发、斑秃和休止期脱发。
人真皮毛乳头细胞（Human Dermal papilla cells, HDPCs）在毛发生长和毛囊周期中起着核心的调控作用，它们是毛囊中的间充质细胞，具有成体干细胞的特性，能够影响毛囊的发育、毛发的生长周期以及毛囊的再生。毛乳头细胞通过分泌各种生长因子和细胞信号分子，调控毛囊上皮细胞的增殖、分化和凋亡，从而影响毛发的生长和脱落。因此被用于评估毛发生长调节剂在细胞和分子水平上的作用，是研究化合物对毛囊毛发作用的体外筛选模型之一。
防脱生发的体外评价，通常是根据所建立的应激诱导模型中标记物的变化，以此来考察药物对HDPCs活性的调节作用。常见的应激诱导模型，如H2O2氧化损伤，UVB损伤，退行期诱导（地塞米松，IFN-γ，DHT，皮质醇等）。1）氧化应激会导致DNA、蛋白质和脂质的损伤，从而导致头发变白和脱发，H2O2可通过氧化应激对毛发造成损伤，引起毛发干枯，甚至导致脱发的发生；2）紫外线（UV）辐射通过直接破坏DNA和间接产生活性氧（ROS）来损害细胞内功能，从而诱导细胞周期阻滞和凋亡；3）男性睾丸中的5α-还原酶使卵泡内的睾酮（T）转化DHT，DHT通过激活雄激素受体（AR），刺激HDPCs分泌TGF-β1，使毛囊由生长期向退行期转化，缩短毛囊生长期，抑制毛囊细胞增殖；4）当人体感受到压力时，体内皮质醇水平升高，毛囊干细胞分泌的长停滞特异性蛋白6（GAS6）被抑制，毛囊干细胞活性降低，毛囊休止期延长，抑制HDPCs的增殖，并抑制生长因子的表达，由此导致毛发再生减少。心理压力会刺激糖皮质激素（GC）的分泌，GC由毛囊分泌，地塞米松（DEX）通过降低毛囊生长因子VEGF和HGF的表达，抑制HDPCs的增殖，致使细胞活力降低，延长毛囊的退行期。干扰素IFN-γ是参与调节毛囊循环的细胞因子之一，是一种毛囊退行期诱导剂。IFN-γ可降低毛囊生长激活因子β-catenin，激活糖原合成酶激酶（GSK）-3β，增强Wnt抑制剂DKK-1和退行期诱导因子（TGF）-β2的表达。
因此本实验拟利用人真皮毛乳头细胞构建实验模型，通过检测Wnt/β-catenin、TGF-β/BMP、Notch、HH和PI3K/AKT信号通路相关指标，评价样品是否具有防脱发功效。
2、检测项目
3.检测流程
4.部分结果展示
图1.细胞存活率（%）柱形图
与正常对照组比，**p<0.01
图2AR基因相对表达量柱形图
与模型对照组比，***p<0.01
图3DDK1基因相对表达量柱形图
与模型对照组比，**p<0.01，***p<0.001
图4.VEGF基因相对表达量柱形图
与模型对照组比，*p<0.05，***p<0.001
图5.β-catenin基因相对表达量柱形图
与模型对照组比，***p<0.001
5.结果描述
根据测试结果，与正常对照组比，阳性对照组的细胞存活率显著上调，说明本实验有效且可靠。与正常对照组比，模型对照组的AR，DDK1基因相对表达量显著上调，VEGF，β-catenin基因相对表达量显著下调；与模型对照组比，阳性对照组的AR，DDK1基因相对表达量显著下调，VEGF，β-catenin基因相对表达量显著上调，说明本实验有效且可靠。
6.参考文献
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