eBioMedicine:基于人源胆管类器官模拟缺血再灌引起的胆管损伤,筛选新型胆管保护剂

发布时间:2023-04-25 环特生物 浏览次数:2773

编者按:胆管上皮细胞在缺血再灌注时极易受到损伤,因此肝移植过程中缺血性胆管病是治疗失败的主要原因之一[1-3]。目前,胆管上皮对缺血和再灌注的反应被广泛认为是动态的和阶段性的,但由于缺乏合适的细胞或动物模型,胆管缺血损伤的分子机制很大程度上仍未被探索。

肝源性胆管细胞是人类胆管上皮细胞的一种,它们能够自我组装并在体外保留大多数胆管特征[4-6]。在本研究中,研究人员利用人源肝内胆管类器官(ICOs)进行缺氧/复氧刺激模拟缺血性胆管损伤,观察到胆管细胞增殖的动态变化、上皮-间充质转化(EMT)相关标志物上调等,与患者组织结果相似。在缺血和复氧时细胞呈现出不同阶段的死亡模式,而caspase抑制剂不能缓解缺血性胆管损伤,反而进一步促进了细胞坏死。此外,临床级α-1 antitrypsin(ATA1)被发现能抑制胆管细胞的凋亡从而发挥胆管保护作用。本研究为胆管疾病的机制研究及药物筛选提供了强有力的工具。

一、主要研究结果

1. 对转染HIF-1α报告基因的ICOs进行不同缺氧时间的处理,72h后细胞中的HIF-1α大量表达,呈现缺氧反应。此时,类器官体积显著减小,有发黑现象。接着复氧6h,ICOs中肌动蛋白细胞骨架明显解体,细胞核大量碎裂,显示凋亡样表型。

2. 延长复氧时间至24h,ICOs细胞活力较缺氧时明显增加,表达增殖标记物Ki67的细胞比例增加。这些结果与之前的研究一致,提示缺血抑制胆道增殖,再灌注后可在一定程度上恢复其增殖能力。

3. 利用转录组学测序分析缺氧及复氧条件下ICOs中基因变化情况,结果显示胆管细胞相关基因(MMP7、LGALS2、SOX9、GGT6、PPFIBP2、CFTR等)和上皮细胞表达基因(ANXA4、CD24、HNF1B等)整体下调;在缺氧的ICOs中,与EMT相关的基因(ITGB3、LOXL2、VIM、TGFB1和PLOD2)明显上调。免疫染色进一步证实缺氧处理后ICOs中TGF-β和N-cadherin的表达增加,与患者组织切片染色结果一致。这些数据表明在缺氧/复氧应激刺激和肝移植会促进ICOs中EMT相关标志物的上调。

4. 鉴于缺血再灌注时可引起肝脏不同程序的细胞死亡,研究人员对ICOs刺激后凋亡和坏死相关基因的转录谱进一步分析,结果显示内源性凋亡基因在缺氧和复氧条件下均上调;复氧后外源性凋亡相关基因(如TRAF2、CASP8和TNFRSF10A)明显上调;同时,复氧时坏死相关基因(如MLKL, PGAM5和DNM1L)也出现了上调。凋亡及坏死相关标志物(active caspase 3、cleaved caspase 8和pMLKL)的免疫荧光染色也验证了上述结果。这些发现表明在缺血再灌注模拟条件下生长的ICOs在特定阶段会诱导凋亡和坏死。

5. 使用ICOs在缺氧/复氧刺激造模条件评价化合物的药效,结果显示口服caspase抑制剂Emricasan无论是缺氧或复氧条件下都未能挽救ICOs,类器官持续发黑,细胞核固缩。Emricasan抑制了缺氧条件下ICOs caspase 3的活性,但表达pMLKL+的细胞显著增多,提示其引起了坏死性凋亡。而丝氨酸蛋白酶抑制剂ATA1恢复了缺氧和复氧过程中ICOs的上皮结构,抑制了缺氧诱导的ICOs中caspase 3的激活和MLKL的磷酸化,表明A1AT对缺氧/复氧诱导的损伤发挥了保护作用。

二、结语

作为斑马鱼生物技术的全球领导者,环特生物搭建了“斑马鱼、类器官、哺乳动物、人体”四位一体的综合技术服务体系,开展科研及研发服务、智慧实验室建设和精准医疗三大业务。目前,我们已研发出成熟的胆管类器官培养基,欢迎前来咨询!


参考资料:

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[2] Nakanuma Y. Tutorial review for understanding of cholangiopathy. Int J Hepatol. 2012; 2012: 1–9.

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[5] Verstegen MMA, Roos FJM, Burka K, et al. Human extrahepatic and intrahepatic cholangiocyte organoids show region-specific differentiation potential and model cystic fibrosis-related bile duct disease. Sci Rep. 2020; 10: 21900

[6] Huch M, Gehart H, van Boxtel R, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015; 160: 299–312.

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