编者按

肺泡发育的变异与疾病易感性密切相关。研究表明，人类气道在受孕5-16周时形成分支，到26周左右进一步分化为肺泡上皮[1-2]。由于缺乏合适的模型，肺泡发育的相关分子机制很大程度仍然未知。

在本研究中，研究人员利用人胎儿肺组织发现决定肺泡命运的上皮祖细胞，并通过体外培养成的类器官模型挖掘肺部细胞发育的关键进程。利用该模型，研究人员从功能上验证了人类肺泡发育过程中细胞间的相互作用，确定肌成纤维细胞在发育肺泡中的空间模式。同时，该研究还发现了可调控肺泡成熟的重要转录因子NKX2.1，为疾病建模提供了可基因编辑的人源AT2细胞。

一、 研究成果

1. 对不同周期的人胎肺尖端区域组织进行单细胞测序，鉴定出包括气道祖细胞、AT1、AT2等在内的11个上皮细胞簇。聚类结果显示这些细胞主要分布于两个阶段，即受孕后5-11周（早中期）和受孕后15-22周（晚期）。其中，晚期尖端细胞与气道祖细胞、AT2和AT1细胞密切相关，表明晚期时尖端细胞获得了肺泡分化能力。

对差异基因进行分析，结果显示CD44和CD36的双重表达标志受孕15-21周的肺尖端上皮群体，该群体共同表达尖端祖细胞和肺泡标志物。而在肺泡形态分化之前，CD36在受孕13-15周时已得到稳定的表达。此时，SFTPC转录增加，SOX9转录逐渐减少，表明AT2谱系特征的获得在肺泡分化之前已逐渐发生在尖端。

2. 为了确认受孕17-21周肺部远端尖端细胞的命运潜能，研究人员对表达

CD44+ CD36+细胞进行体外培养，得到囊状和折叠状两种形态的类器官。

前者表达尖端祖细胞特异性基因，无AT2相关表达，接近气道分支阶段的尖端标记，被认定为LinNEG谱系；而折叠状类器官同时表达祖细胞及AT2细胞标记物，被命名为LinPOS谱系。转录组分析结果显示呼吸道气体交换、肺泡发育及典型的Wnt通路信号在LinPOS类器官中有显著富集，其富含AT2标记物、Wnt信号相关基因及低水平气道基因。

这些数据表明传代的LinPOS类器官可概括肺泡及晚期肺尖祖细胞的关键分子特征。其中，只有CD44+ CD36+细胞衍生形成的LinPOS类器官能够在多次传代中维持自我更新能力。

3. 为了测试LinPOS类器官是否具有AT2的分化潜力，研究人员向培养体系中加入DAPT、DCI、CHIR 和SB431542，单细胞测序结果表明在条件培养基体系下LinPOS类器官很容易分化为成熟的AT2细胞。

同时，研究人员发现晚期尖端上皮细胞具有高度可塑性，可以在肺泡和气道分化之间轻松切换，而这一过程受到Wnt和FGF信号通路的协调控制。

4. 为了验证Wnt和FGF信号对体内远端尖端上皮细胞的谱系决定作用，研究人员对受孕后17-21周的组织进行单细胞测序分析，结果显示WNT2与FGFR4在这些阶段的肺泡成纤维细胞中共同表达。

通过将LinPOS类器官与成纤维细胞共培养，并使用Wnt信号通路抑制剂及激动剂进行处理，结果表明分化的成纤维细胞发出的Wnt信号可促进AT2细胞的识别，而肌成纤维细胞可分泌Wnt抑制剂NOTUM，提供空间模式，支持了分化的肺泡上皮由肌成纤维细胞塑造的概念。

5. 为了探究影响细胞分化的关键转录因子，研究人员利用LinPOS类器官进行了染色质可及性和测序分析，发现NKX2.1和TFAP2C等转录因子基序可及性很高，且这些转录因子均被高度转录。

通过对7-9 pcw类器官过表达NKX2.1 和TFAP2C，前者可导致AT2标记物的上调以及尖端祖细胞标记物的下调；而后者可显著增加基底细胞标志物的表达，故而这两者被认为分别是AT2和基底细胞系分化的关键调控因子。

在LinPOS类器官中NKX2.1和TFAP2C的敲低实验进一步支持了NKX2.1在促进肺泡和抑制气道分化中的重要性。NKX2.1表达的小幅下降足以降低AT2特异性基因的表达，增加TP63，而TFAP2C 的敲除不影响AT2基因的转录。

6. 此外，通过对缺乏同源结构域的NKX2.1过表达，研究人员发现DNA结合是NKX2.1促进AT2分化所必需的。已知NKX2.1变异被报道与多种呼吸道疾病相关[3-5]，基于此可通过基因编辑进行不同部位的突变，从而预测人类变异体对肺泡分化的不同影响。

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