论文解读丨基于传统分级经验指导下的非靶向代谢组学与斑马鱼心肌缺氧模型鉴别三七质量标志物

发布时间:2023-08-10 环特生物 浏览次数:1540

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编者按

三七(Panax notoginseng,PN),作为我国传统的名贵中药,是临床使用最广泛的中药材之一,常用于散瘀止血、消肿定痛等。然而,目前三七商品规格等级混乱、质量参差不齐、产地变迁、外源性污染物等问题愈发严峻,传统的以规格大小评判三七质量的方法已无法与传统的分级经验精准匹配。

基于此,为建立传统分级方法导向的三七质量整体评价体系,发现可真实反映经验鉴别的质量标志物,环特生物与中国中医科学院中药研究所研究员赵海誉团队合作,2023年3月在《Phytomedicine》杂志上发表了题为“The grading quality markers identification of Panax notoginseng under the guidance of traditional experience using untargeted metabolomics and anti-myocardial ischemia evaluation of zebrafish”的研究论文(中科院一区IF=7.33),在传统分级经验的指导下,采用非靶向代谢组学和斑马鱼心肌缺氧模型相结合的方法对三七进行评价,并发现炔醇、皂苷等差异性成分是可以真实反映三七优劣的传统经验质量标志物,建立了以传统经验为指导的三七“经验-效应-成分-电子感官”质量综合评价体系,为综合评价三七的质量提供了一个新的方向。本期,我们一起来解读本篇文章——

https://doi.org/10.1016/j.phymed.2023.154674

一、研究背景:

三七(PN)是五加科植物三七Panax notoginseng(Burk .)F .H .Chen的干燥根和根茎。作为一种药用和食用的中草药,已使用600多年。在美国药典中,三七被批准作为促进膳食补充剂,促进血液循环。此外,三七可以“散瘀止血,消肿定痛”;它也是一些中成药的主要原料,如“云南白药”即以三七作为止痛剂、抗凝剂而闻名。

目前,三七的质量评价方法一般有两种:一种是根据传统的分级经验确定的质量控制方法,其沿袭传统实践而来,并依据产地、外观、颜色、气味、采收季节、头数等多维度经验来进行系统、综合性评价,一个经验丰富的从业者可以根据这些经验特征有效地对三七质量分级。但囿于主观经验因人而异,难以客观化表征,描述也过于专业,消费者无法理解;大多数研究将三七等级与成分联系起来,因此,对三七质量分级的准确描述尚未推广应用。

当前市场上的标准规格等级划分方法是基于传统经验识别的简化版本,其核心原则是通过三七的外形大小(头数)来确定,个头越大,规格等级越高,然而,单一的评估指标,受到了滥用植物膨大剂的严重影响,无法再单纯凭三七个头的大小来判断其质量优劣。

另一种质量评价方法是以皂苷类成分含量为质量标志物的评价方法,已收录于《中国药典》中。然而,皂苷位于三七的韧皮部和外围,皂苷类成分的含量与规格大小负相关(Yang et al.,2021)。

因此,上述两种方法是否合理仍有待确定,目前的做法仍然有验证和改进的空间,基于此,迫切需要一种简单有效的方案来对三七等级进行分级,建立合理可靠的质量评价体系。

与传统的分析方法不同,电子舌不能获得有关化合物性质的信息,只能提供食品材料的数字指纹。这是一个强大的工具,可以在没有主观因素和判断的情况下,表征不同来源的食物味道的细微差异。因此,它可能是对三七进行分级的一个潜在的客观媒介。

同时,综合评价系统应包括一个合适且快速的动物模型。斑马鱼模型是一种快速评价模型,最快一周内即可获得数据结果。此外,与其他模型相比,斑马鱼模型具有操作简单、成本低、效率高、高通量等独特优势,被认为是中药生物效应评价体系的重要载体。三七的“活血化瘀”功效是临床上最关键的指标,斑马鱼心肌缺氧模型是评价三七等级的潜在生物学功效评价模型。

三七中的次生代谢物是具有较强生物学功效特性的潜在质量标志物,可以反映全局信息。基于高分辨率质谱技术的非靶向代谢组学,对无损检测大量分子,包括高极性和低极性成分尤为重要。代谢组学对发现具有全面、客观和高通量特征的传统分级标志物至关重要。通过它,可以实现传统经验的客观化、数字化,以及由来源和存储时间引起的质量变化。正如我们所知,使用单一的碎片化评价方法来表征三七的实际质量需要投入大量的人力物力,因此,有必要建立一种综合策略来评价三七的质量。

应进一步阐述不同分级水平下,三七中成分的差异和相关性。我们希望以皂苷为主要的质量控制指标,提高三七的质量标准,寻找具有分级意义的新标志物。本研究主要关注传统分级经验在三七质量综合评价中的指导作用。电子舌被用来验证传统的评价体系,并客观地展示该评价体系。

在传统经验分级的指导下,研究人员构建了斑马鱼心肌缺氧模型,以验证传统经验评价的准确性;采用基于UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技术的非靶向代谢组学方法,对三七的分级标志物进行了鉴定和验证,为全面评价三七质量提供了新的方向。

二、研究成果:

1. 基于感觉的三七的传统分级评价

根据专家传统经验评价结果,苦味、辣味和甜味更强的三七样品被认为等级更高。口味是三七传统经验评价的主要指标之一,加权因子为0.50。同时,气味浓厚被认为是高等级三七的另一重要特征。然而,专家的评价结果最终与三七主根的大小并不匹配,这表明三七的大小与质量没有直接关系。此外,高规格、等级的三七应该呈绿黄色、外形饱满、无明显凹纹、圆形和紧密结实等。

在经验评价过程中,研究人员发现6位专家对16批三七的具体评分顺序不同,但专家们对三七等级的分类是一致的。因此,研究人员采用平均值作为每批三七的评价结果。从结果来看,感官得分范围为47.0-87.8,如表1所示。根据得分,将16批三七分为两个等级(SPN:70-100,IPN:40-70)。

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表1:传统的三七经验评价结果

2. 基于电子舌进行的传感分析

口味是传统分级经验评价三七质量的中心指标。专家为口味赋的加权因子值为0.5。电子舌可以反映口腔的味道,从而作为传统分级经验评价的指标之一。因此,本研究将电子舌作为味觉传感器,对三七分级进行分析,这是对传统经验的客观化和数字化。

所有数据均为基于人工唾液(无味)的相对输出值。电子舌雷达响应图如图1A所示。其中,三七的酸度低于无味点(-13),回味B和余味A接近无味点。大多数样品的涩味和咸味也低于无味点(-6)。相比之下,苦味、鲜味、丰富性和甜味的价值是显而易见的。

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图1:电子舌鲜味、丰富性传感分析。(A)电子舌分析雷达图;(B) PCA图;(C)加载图;(D)Umami,SPN和IPN的丰富度响应。

通过传感器的响应值对电子舌数据集进行主成分分析,以区分SPN组和IPN组(图1B),与传统经验结果一致。前两个主成分的总体方差为81.3%,其中PC1为55.9%,PC2为25.4%。在PC1轴上,两组几乎重叠,表明味道质量相当。在PC2方向上,SPN组位于上平面,而IPN组位于下平面,这一点可以区分。

图1C显示了各种经验评估样本的传感器信号加载图。咸味和涩味对PC1的贡献更大,而鲜味和丰富性对PC2的贡献更大。值得注意的是,SPN组的鲜味反应值高于IPN组(P<0.0001)。此外,IPN的平均丰富度约为SPN的3倍(P<0.0001)(图1D)。通常,氨基酸和核酸会产生鲜味,丰富度可以模拟出浓郁回味的复杂感觉,这表明SPN具有更浓郁的鲜味,但相对较短,这与传统经验评价的结果一致。

皮尔逊相关系数通常用于反映两个变量之间的统计相关性,P<0.05时相关性显著。本研究分析了鲜味、丰富度(电子舌测量)和经验评价之间的关系。统计分析显示,经验感官得分与鲜味强度呈正相关(P < 0.01),与丰富度则呈负正相关(P < 0.01)。此外,还分析了专家味觉评分与鲜味、丰富度之间的相关性。与预期一致,电子舌的反应强度与专家的味觉高度相关(P < 0.01)。综上所述,我们认为电子舌可以更好地模拟专家的感官体验,并评估三七的质量。鲜味、丰富性传感器是不同经验等级三七的主要差异传感器,还需要进一步的实验来验证这些假设。

3. 斑马鱼心肌缺氧模型评价

基于三七的临床应用和以往的实验结果,研究人员构建了以ISO(异丙肾上腺素)作为诱导剂的斑马鱼心肌缺氧模型,来对16批三七进行抗心肌缺氧功效评价。选取样本1和样本16(即传统经验评价中得分最高和最低的样本)进行初步探究。

首先,通过MTC和初步活性实验确定了最佳给药浓度,三七的MTC为313μg·mL-1(表A.2)。

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表A.2 探究三七的最大耐受浓度(平均±SEM,n=15)

进一步探究三七的给药浓度(表A.3)发现,三七在156-313μg·mL-1的剂量范围内,血流速度增强作用和心输出量增强作用显著,且呈剂量依赖性。给药浓度为313μg·mL-1的三七活血化瘀功效最强,可作为评价三七的最佳给药浓度。

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表A.3 不同给药浓度对Iso诱导的斑马鱼心肌缺氧模型的影响(平均±SEM,n=10)

与模型组相比,三七干预后斑马鱼的血流速度和心输出量均显著增强。16个三七批次的抗心肌缺氧能力汇总见表2。两组间比较有显著性差异(P<0.0001),313μg·mL-1时,SPN组平均血流速度为368.3±10.7μm·s-1,IPN组为239.4±8.1μm·s-1;SPN组的平均心输出量为0.138±0.005 nL·s-1,而IPN组的平均输出量为0.087±0.003 nL·s-1。复方丹参滴丸组,在250μg·mL-1剂量下,血流速度为361.0±12.6μm·s-1,心输出量为0.143±0.005nL·s-1。SPN组与IPN组比较,有显著性差异(P<0.001),且SPN组功效与复方丹参滴丸阳性组相似。

基于这些发现,进一步分析传统经验与抗心肌缺氧活性之间的相关性,将有助于验证传统经验的价值。在本研究中,生物活性与经验分级高度一致。这表明传统经验评价可以一定程度上反映三七的活血功效。研究人员获得了经验感觉评分与三七血流速度之间的皮尔逊相关性为0.788(P<0.01),而心输出量为0.783(P<0.01)。

综上所述,三七具有显著的抗心肌缺氧活性功效,并介绍了经验分级和生物活性之间的正相关性,斑马鱼模型为三七提供了一种经济、快速、简单的生物效应评价方法。

4. 基于非靶向代谢组学的分级标志

非靶向代谢组学可以全面揭示SPN和IPN之间的差异。总离子色谱法(TIC)如图2A所示,对获得的UHPLC-LTQ-Orbitrap MS数据进行PCA分析(图2B中的ESI+,ESIin如图2C所示)。ESI+中,第一和第二主成分方差分别为27.4%和21.6%;ESI-中,第一和第二主成分方差分别23.1%和18.7%。OPLS-DA图显示SPN组和IPN组明显分离(图2D中的ESI+,ESIin如图2E所示)。

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图2:对三七等级进行非靶向代谢组学分析;正模式(B) PCA图;负模式(C) PCA图;正模式(D) OPLS-DA图;(E)负模式的OPLS-DA图;(F)正模式的S图;(G)负模式的S图;(H)正模式的热图;(I)负模式的热图。

根据差异倍数 (Fold Change,FC)、P值、vip值三个标准选择质量分级标志,FC≥1.2或≤0.8,P≤0.1,VIP≥1,分别从正离子模式和负离子模式中过滤出64个和124个微分变量。为了进行验证,研究人员从原始数据中提取了188个离子的差异性成分峰面积,并重新计算了P值和FC值。如果VIP≥1、P≤0.1、FC≥1.2或≤0.8,则成分之间的差异性显著。

通过对非挥发性差异性成分、挥发性差异性成分重新提取得到的峰面积进行归一化处理,并生成热图显示SPN和IPN的差异,得到39个非挥发性和25个挥发性差异性成分,其中14个非挥发性成分、13个小极性成分在经验优等三七中更高,主要为炔醇、皂苷、小分子烯酸、黄酮和萜烯类成分。

而一些未知的炔醇类成分的SPN差异也较高,说明炔醇可能是区分不同经验水平下三七的重要差异性成分。此外,炔醇具有较强的成分特异性和明显的活血功效。

在本研究中,特殊的皂苷也是重要的差异成分,存在于SPN和IPN中。这种差异性主要体现在糖链的数量上。IPN中含量较高的皂苷常与2-4条糖链相连,如人参皂苷Rg2/Rg3、(T-1)-Glc-Glc-(Glc-Xyl)等。相比之下,SPN含量较高的皂甙是具有两个糖链的双糖链皂苷。皂苷是三七的主要有效活性成分,是《药典》的基本指标。药典指标皂苷为达玛烷型三萜皂苷,不能区分SPN和IPN。

三七的成分是复杂的,我们认为,皂苷并不能全面评价三七的质量标志物,仅通过皂苷的含量测定来评价三七的质量显然是不合适的。因此,后续研究将挖掘SPN和IPN之间的分级标志,如炔醇和类黄酮等,并对其效果进行验证。

5. 分级标志物的抗心肌缺氧功效验证

为验证差异性成分的价值,采用ISO诱导的斑马鱼心肌缺氧模型快速评价传统分级标志物的功效。斑马鱼活性验证实验显示,炔醇类成分、白桦酯醛具有较好的抗心肌缺氧能力,其中人参炔醇、人参环氧炔醇(实为炔醇类混合物)活性效价高于药典指标成分。

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图3:分级标志物的功效验证。(A)血流速度;(B)心输出量。

图3表明,在浓度为10µM时,传统的非挥发性分级标志物人参二醇和人参烯醇显著提高了斑马鱼的血流速度和心输出量(P<0.0001),药典指标中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷R1成分可显著提高斑马鱼的血流速度和心输出量(P<0.0001);人参二醇和人参烯醇的活性略高于人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1。人参炔醇、人参环氧炔醇可能是三七的重要药效学成分,具有强大的抗心肌缺血作用。

这些结果也表明,非挥发性传统分级标志物的差异可能是SPN和IPN生物学效应的不同指标。此外,炔醇的抗心肌缺氧活性约是皂苷的10倍,应将其纳入三七的质量控制标准。

三、结论:

本研究探讨了三七的传统分级经验的价值,以感官评价为指导,结合代谢组学和活性评价,评价了不同质量的三七成分之间的差异。具体来说,基于感官评价的三七分级具有指导意义,斑马鱼功效评价实验也验证了这一点。

通过电子舌分析,客观评价不同等级的三七在感觉方面的质量差异。先进的代谢组学技术筛选和鉴定了不同的物质,结果表明,高等级三七中人参炔醇、人参环氧炔醇等炔醇类成分、白桦酯醛含量较高。

此外,斑马鱼活性实验评价结果显示,在代谢组学研究中存在显著差异的炔醇具有抗心肌缺氧的功效。炔醇与判断经验的密切关系比皂苷更为显著。因此,在三七的分级质量控制中,不仅应包括皂苷,还应包括炔醇,目前这项研究还存在一定的局限性,如实验中使用的样本数量有限,需要更多的样本进一步验证。

总之,本研究确定了一种新的三七分级质量标志物——炔醇,它与三七的功效高度相关。此外,经过本文方法的筛选和验证后,用于三七分级的质量标志物(基于感官评估)不仅可以改进和补充现有标准的不足,也显示出生物活性造福人类的巨大潜力。

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