离体皮肤拉曼光谱渗透性测试方案

【实验原理】

化学物质的透皮吸收是指化合物作用于皮肤表面、进入表皮或真皮，并在该部位聚集和发挥作用的过程，影响物质透皮吸收的因素主要分为皮肤自身性质和其他因素。化学物质直接经皮吸收的途径分为细胞间途径、跨细胞途径、旁路途径（毛囊，汗管等皮肤附属器），其中跨细胞途径，即透过角质层的细胞膜是皮肤吸收的主要途径。研究物质在皮肤中的渗透及分布，可以为产品配方优化、功效评价等提供重要的数据支持。

拉曼散射光谱，也被称为拉曼光谱，是一种振动光谱技术，也是物质的一种固有性质，可以非常灵敏地反应物质的组成，具有无损、原位分析等特点，光谱信号强度与待分析物浓度成正比。此外，拉曼光谱具有微米级的空间分辨率和良好的穿透能力，能高空间分辨率地研究待分析物在皮肤内的空间分布。因此，可以使用人体在体皮肤或离体皮肤，通过将受试物作用在皮肤表面，再结合拉曼光谱技术来检测化学物质的透皮吸收特性。

【实验方案】

1、样品拉曼光谱检测：使用LabRAM Soleil超高分辨显微共聚焦拉曼光谱仪对样品本身进行拉曼光谱检测，分析其特征峰并与皮肤本征拉曼特征峰进行对比。

2、人离体皮肤的获取：从医院获取新鲜人离体皮肤，使用医用酒精消毒，剥离皮下脂肪组织，并裁剪成适量大小以备用。

3、样品的使用：重组胶原蛋白10个样品，以纯化水为溶剂，稀释后按照使用量5 mg/cm2，作用于离体皮肤。

4、样品透皮吸收拉曼检测：选择适当的测试皮肤面积，使用超高分辨显微共聚焦拉曼光谱仪分别在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h时间点对样品作用后的离体皮肤进行拉曼光谱检测。

5、结果统计分析：根据拉曼光谱的检测结果，处理拉曼光谱成像数据，包括光谱预处理和数据分析。样品的渗透性行为利用该样品区别于皮肤本征信号的特征拉曼信号确认其在不同皮肤深度空间中的分布。相对渗透率（%）=进入到皮肤内的活性物拉曼光谱强度/在皮肤上施加的活性物的拉曼光谱强度× 100%。

【评价指标】

1、不同时间点样品渗透的拉曼光谱成像

2、不同时间点样品的相对渗透率

【结果展示】

图1. 不同样品作用于离体皮肤后拉曼渗透图像

通过对图1拉曼图像的深度分析，可以获得不同样品在不同时间点下在离体皮肤不同深度的分布，其分布图如图1所示，可以看到：样品1在1 h内渗透至活性表皮层，样品2、样品3、样品4在1 h内均渗透至真皮层。从检测的全时间段来看，所有样品整体呈现出一种持续向下渗透的趋势。样品1（样品2、样品3、样品4）在不同时间点的渗透率分别为A%、B%、C%、D%。

【参考文献】

[1]Eberlin S, Silva MSD, Facchini G, et al. The Ex Vivo Skin Model as an Alternative Tool for the Efficacy and Safety Evaluation of Topical Products. Altern Lab Anim. 2020;48(1):10-22.

[2]张静姝, 王言之.透皮吸收实验推导皮肤吸收值的规范化研究[J]. 毒理学杂志, 35(1):4.

[3]沈心怡,胡韵池,熊訚然,等.拉曼光谱成像技术在药物经皮渗透行为考察中的应用[J].中国医药工业杂志, 2023, 54(5):683-690.

[4]林漫漫, 常静, 张朋, 等. 激光拉曼光谱技术在生物活体研究中的应用进展. 广西科学, 2021, 28(6): 557-567. 

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