化妆品改善线粒体活力作用实验方案

1、实验原理

线粒体是由两层膜包被的半自主细胞器，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，能够为细胞生命活动提供高达95%的所需能量。线粒体除了具有合成ATP的功能之外，还具有调节ROS产生、维持细胞内Ca2+稳态和参与细胞信号转导等功能。当线粒体功能紊乱时，会导致线粒体功能障碍，线粒体功能障碍主要表现在线粒体能量代谢、线粒体氧化应激、线粒体介导的凋亡、线粒体自噬、线粒体通透性转换以及线粒体生物合成等方面异常。

图1.线粒体在真核细胞能量代谢、细胞死亡和氧化应激中的作用

三磷酸腺苷（ATP）作为最重要的能量分子，在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用，ATP水平的改变，会影响细胞的功能。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，ATP水平会下降；而高葡萄糖刺激等可上调某些细胞的细胞内ATP水平，通常ATP水平的下降表明线粒体的功能受损或下降。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是细胞内的重要辅酶，在细胞代谢过程中起着至关重要的作用，NAD+是NADH的氧化形式，二者通过氧化还原相互转化，参与多种生物反应过程，提供能量并参与生物分子的合成，以维持细胞正常的功能和代谢活动。NAD+同时在细胞内参与产生三磷酸腺苷（ATP）等能量分子的过程，有助于维持皮肤细胞的正常功能和活力。

线粒体膜电位是线粒体正常功能的基础，它由呼吸链复合体的活动产生，是驱动线粒体ATP合成、钙离子摄取等重要生理过程的动力。当线粒体膜电位下降时，ATP合成减少，细胞能量代谢紊乱，膜电位的变化是线粒体功能障碍的一个重要标志，JC-1是一种用于检测线粒体膜电位的荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1通过特异性地与线粒体内膜结合，以聚合物的形式聚集在线粒体的基质中，产生红色荧光；在线粒体受到损伤时，线粒体膜电位降低，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光，因此JC-1荧光颜色的转变可以反映线粒体膜电位的变化。

本实验拟利用人永生化角质形成细胞/人真皮成纤维细胞构建实验模型，通过检测线粒体膜电位（JC-1）变化，ATP含量，NAD+/NADH含量，多维度评价样品是否具有改善线粒体活力作用。

2、检测项目

3.检测流程

4.部分结果展示

图1.线粒体膜电位红/绿荧光强度比值典型图

图2.ATP含量柱形图

与正常对照组比，**p<0.01

图3.NAD+/NADH柱形图

与正常对照组比，*p<0.05

图4.样品处理成纤维-ATP探针稳转细胞株 24 h成像结果

5.结果描述

根据测试结果，与正常对照组比，模型对照组的线粒体膜电位红/绿荧光强度比值显著下调，与模型对照组比，阳性对照组线粒体膜电位红/绿荧光强度比值显著上调，与正常对照组比，阳性对照组的ATP含量，NAD+/NADH比值，显著上调，说明本实验有效且可靠。

6.参考文献

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