利用细胞评价供试品抗光老化功效

项目一：MMP-1含量

【实验原理】

光老化主要由太阳光暴露、自由基和物理刺激引起。到达我们皮肤的紫外线主要由90-95%的UVA和5-10%的UVB组成，过度暴露于UVA/UVB与皮肤衰老相关。皮肤松弛、皱纹产生主要是真皮组织以及真表皮连接处（DEJ区）出现的问题 ，从成分和结构来看，胶原蛋白含量减少及结构紊乱。究其背后更深层次的原因：自由基的过量产生、蛋白质羰基化和糖基化修饰、基质金属蛋白酶（MMPs）的过度表达。已有研究表明，MMP-1 可以降解Ⅰ型和Ⅲ型等多种胶原纤维。因此，本实验通过测定给药后MMP-1含量，来评价样品是否具有抗光老化功效。

【实验方法】

实验一：MTT法检测样品对人真皮成纤维细胞的细胞毒性实验

1）细胞接种：接种细胞于96孔板内（1 × 10^4个/孔），于37 ℃，5% CO2中培养24 h。

2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。

3）孵育结束后向每孔中加入MTT溶液，继续培养4 h。

4）去培养液，加入DMSO溶液，振荡混匀，测定490 nm处吸光度值。

OD490：490 nm处的吸光度值

实验二：样品对UVA辐射后人真皮成纤维细胞的MMP-1的表达

细胞接种：将细胞以6 × 105个/孔接种于6孔板，于培养箱（37℃、5%CO2）中培养12 h，分别设置正常对照组（0 J/cm2+0 mM样品）、模型对照组（5 J/cm2+0 mM样品）、低浓度组（5 J/cm2+A mM样品）、中浓度组（5 J/cm2+B mM样品）、高浓度组（5 J/cm2 + C mM样品）。

UVA造模：UVA辐射前细胞用D’Hanks洗3遍，在孔中加入 1 ml D’Hanks，使之浸没细胞，对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组，对需要辐射的组分别进行UVA造模（5 J/cm2）；

给药：各试验组中分别加入含有不同浓度样品的 DMEM 培养基中继续培养24 h；

收样及检测：每孔取180μL培养上清，用 ELISA试剂盒检测MMP-1的含量。

【评价指标】MMP-1含量

【评价结论】

供试品组与模型组相比，MMP-1含量降低且具有显著性差异（P＜0.05），初步证明该供试品具有抗光老化功效。

【参考文献】

[1]林荣锋. 广藿香油对UV所致小鼠皮肤光老化模型保护作用的实验研究[D].广州中医药大学.2015.

[2] Leccia MT, Richard MJ, Favier A, Béani JC. Zinc Protects Against Ultraviolet A l-lnduced DNA Damage and Apoptosis in Cultured Human Fibroblasts[J]. Biol Trace Elem Res. 1999,69(3)

[3] Abidullah khan, Hongliang Bai, Maoguo Shu. Antioxidative and antiphotoaging activities of neferine upon UV-A irradiation in human dermal fibroblasts[J]. Bioscience Reports .2018

项目二：ROS 清除率、SOD 酶活性和 GSH 含量

【实验原理】

生物体进行呼吸代谢等氧化反应会产生活性自由基，在正常机体环境下，自由基具有稳定的清除系统，使得机体自由基含量保持较低浓度的平衡。氧化应激（Oxidative Stress, OS）是指机体由于受到内源性和（或）外源性刺激，使得体内氧化与抗氧化作用间的平衡失常，自由基产生过多。过多的自由基在体内产生一系列负面作用，可氧化损伤生物分子，并进一步引起细胞死亡和组织损伤等。生物体内，除极微量的ROS被机体利用外，几乎所有的ROS都应当及时被清除。中波红斑效应紫外线 ( UVB) ( 280-319 nm) 辐射损伤是引起皮肤光老化最重要的因素，主要损伤皮肤角质形成细胞 ( HaCaT)，具体表现为光产物积累、ROS上升及氧化损伤加剧等。生物体在长期的进化过程中形成了一套完整的抗氧化体系，使自由基的产生与消除处于动态平衡，是生物体的一种适应性机制，主要成员包括抗氧化酶、抗氧化剂以及分隔过渡金属的蛋白等，它们均可特异性地限制机体的氧化损伤。

其中，紫外线辐射诱发的氧化损伤与抗氧化酶（包括超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（CAT））的活性有密切关系。 例如，SOD可将超氧阴离子转化为低毒性的H2O2和O2，而CAT可进一步将H2O2分解为无毒性的H2O和O2。而谷胱甘肽（GSH）则属于机体内另一种非酶抗氧化剂之一。 谷胱甘肽（GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合的三肽，GSH的结构中含有一个活泼的巯基（-SH），易被氧化脱氢，这一特异结构使其成为体内主要的抗氧化剂。而且GSH是多种酶如GSH-Px的辅酶，涉及多种生物学过程，参与清除ROS，防护氧化应激对机体产生的损伤。GSH的含量可在一定程度上反映机体的抗氧化能力。研究表明，GSH的缺失会破坏细胞的氧化还原稳态，导致ROS累积，最终引发细胞损伤甚至死亡。因此，可以通过检测UVB辐射后角质形成细胞中ROS清除率、SOD活性和GSH含量，以此几个维度指标初步判定样品是否具有抗光老化功效。

【实验方法】

实验一：MTT法检测样品对HaCaT的细胞毒性实验

1）细胞接种：接种细胞于96孔板内（1 × 10^4个/孔），于37 ℃，5% CO2中培养24 h。

2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育24 h。

3）孵育结束后向每孔中加入MTT溶液，继续培养4 h。

4）去培养液，加入DMSO溶液，振荡混匀，测定490 nm处吸光度值。

OD490：490 nm处的吸光度值

实验二：MTT法检测UVB不同辐射剂量对HaCaT的细胞毒性实验

实验方法参考实验一

实验三：样品对UVB辐射后HaCaT的ROS清除效率

细胞接种：将HaCaT以2 × 10^4个/孔接种于96孔板，于培养箱（37℃、5%CO2）中培养12 h，分别设置对照组（X mJ/cm2+0 mM样品）、低浓度组（X mJ/cm2+A mM样品）、中浓度组（X mJ/cm2+B mM样品）、高浓度组（X mJ/cm2 + C mM样品）阳性药组（X mJ/cm2 + N-乙酰-L-半胱氨酸）。

UVB造模：UVB辐射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在孔中加入 50 ul D’Hanks，使之浸没细胞，对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组，对需要辐射的组分别进行UVB造模；

给药：各试验组中分别加入含有不同浓度样品的 DMEM 培养基中继续培养24 h；

ROS荧光探针转载：按照1:1000的稀释比例，采用PBS稀释DCFH-DA至终浓度为10 μmol/L。除裸细胞孔外，弃掉其余孔中的培养基，用PBS清洗3次后，每孔加入200 ul DCFH-DA工作液，CO2培养箱孵育30 min，孵育结束后，PBS清洗各孔内细胞3次；

5） 荧光分析。将待测96孔板置于荧光酶标仪检测台上，设置入射光波长525 nm，激发光波长488 nm，读数分析。

6） 计算。根据各组实验荧光强度，计算样品对ROS的清除效率。

注：本实验方法中的样品的浓度和辐射剂量因实验一和二结果而定。

实验四：样品对UVB辐射后HaCaT中SOD活性影响

细胞接种：将HaCaT以1×106个细胞/孔接种于6孔板，于培养箱（37℃、5% CO2）中培养12 h，分别设置对照组（X mJ/cm2+0 mM样品）、低浓度组（X mJ/cm2+A mM样品）、中浓度组（X mJ/cm2+B mM样品）和高浓度组（X mJ/cm2+C mM样品）。

2）UVB造模：UVB辐射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在每个培养皿中加入 1ml D’Hanks，使之浸没细胞。对各组进行X mJ/cm2 UVB造模；

3）给药：照射后，立即去除D’Hanks，根据试验分组加入不同浓度样品的 DMEM 培养基中继续培养24 h；

4）收集细胞：培养结束后，收集细胞样，进行后续SOD活性测定（具体流程参考SOD酶活性试剂盒说明书）；

注：本实验方法中的样品的浓度和辐射剂量因实验一和二结果而定。

实验五：样品对UVB辐射后HaCaT中GSH含量影响

细胞接种：将HaCaT以1×10^6个细胞/孔接种于6孔板，于培养箱（37℃、5% CO2）中培养12 h，分别设置对照组（X mJ/cm2+0 mM样品）、低浓度组（X mJ/cm2+A mM样品）、中浓度组（X mJ/cm2+B mM样品）和高浓度组（X mJ/cm2+C mM样品）。

2）UVB造模：UVB辐射前HaCaT用D’Hanks洗3遍，在每个培养皿中加入 1ml D’Hanks，使之浸没细胞。对各组进行X mJ/cm2 UVB造模；

3）给药：照射后，立即去除D’Hanks，根据试验分组加入不同浓度样品的 DMEM 培养基中继续培养24 h；

4）收集细胞：培养结束后，收集细胞样，进行后续GSH含量测定（具体流程参考GSH含量测定试剂盒说明书）；

注：本实验方法中的样品的浓度和辐射剂量因实验一和二结果而定。

【评价指标】

ROS清除率、SOD酶活性及GSH含量    

【评价结论】

1、与对照组相比，实验组中样品对ROS的清除率、SOD酶活性及GSH含量均且具有显著性上调且呈现剂量相关性（P＜0.05），初步证明样品具有抗光老化功效。

【参考文献】

[1]郭砚, 孙娟, 王丽雯. 藏雪莲水提取物对中波红斑效应紫外线辐射后人角质形成细胞中蛋白表达的影响研究[J]. 中国全科医学, 2015(24): 2929-2933.

[2] Kulms D, Zeise E , P, Ppelmann B , et al. DNA damage, death receptor activation and reactive oxygen species contribute to ultraviolet radiation-induced apoptosis in an essential and independent way.[J]. Oncogene, 2002, 21(38): 5844-5851.

[3] Ko H J , Kim J , Ahn M , et al. Ergothioneine alleviates senescence of fibroblasts induced by UVB damage of keratinocytes via activation of the Nrf2/HO-1 pathway and HSP70 in keratinocytes[J]. Experimental Cell Research, 2021, 400(1): 112516.

[4] 林勇, 刘硕, 朱华伟,等. 红树莓对UVB诱导HaCaT光损伤的抑制作用[J]. 湖南农业大学学报(自科版), 2015, 041(005): 474-479.

[5] 冯丹, 刘婷, 李冠汝,等. 蒿秦化斑方对紫外线B诱导的HaCaT细胞光损伤的影响[J]. 环球中医药, 2020, 13(5): 6.