斑马鱼基因敲除品系制备

服务简介

1.基因敲除（Gene Knockout）

通过CRISPR/Cas9技术，根据给定Gene ID或Gene name，分析基因保守结构域，在保守结构域或客户指定区域设计靶点并合成sgRNA，sgRNA同Cas9蛋白混合（RNP）共注射使基因产生双链断裂，通过生殖系传递和测序筛选得到稳定遗传品系。

2.基因敲除技术特点

2.1相较于瞬时或间接干预手段，基因敲除技术从根本上阻断基因的正常转录与翻译，避免了代偿性表达或脱靶干扰带来的假阳性结果，因果关系更为明确。

2.2除目标基因位点外，基因组其余部分与野生型高度一致，通过将基因敲除斑马鱼品系与野生型相比较，研究者可以揭示特定基因的功能。

2.3获得的突变能够稳定遗传给后代，形成可永久保存的突变品系。

服务流程

▲基因保守结构域分析→▲多个sgRNA靶点的设计及合成→▲高效sgRNA靶点的筛选及效率验证→▲F0代斑马鱼的可遗传性筛选→▲杂合子F1代斑马鱼的基因型鉴定→▲纯合子F2代斑马鱼的筛选

环特生物优势

成熟的基因敲除技术快速获得稳定品系；

多靶点共注射F0代验证基因功能。

斑马鱼敲除品系成功案例

1、基因分析

分析目的基因的保守结构域；

2、靶点筛选

设计4个sgRNA靶点，PCR检测包含靶点的区域真实序列，显微注射验证靶点效率；

3、大规模注射养殖F0

sgRNA注射，养殖F0成鱼约50条用于后期Founder筛选；

4、Founder筛选

F0代斑马鱼与野生型外交，收集48 hpf的F1胚胎提取基因组，测序鉴定，测序结果在靶点位置出现双峰的认为产生突变；

5、F1 代筛选

F1代斑马鱼剪尾筛选，TA clone验证突变方式：

    通过对测序图谱的分析获得突变方式为：-5bp，产生移码突变的敲除斑马鱼；

    通过对测序图谱的分析获得突变方式为：-4-3bp，产生移码突变的敲除斑马鱼模型。

参考文献

Hwang WY, Fu Y, et al.. Nat Biotechnol. 2013 Mar;31(3):227-9.pdf

Hoshijima K, Jurynec MJ, et al. Dev Cell. 2016 Mar 21;36(6):654-67.pdf

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