研究进展丨斑马鱼模型在昼夜节律研究中的应用进展

发布时间:2024-07-04 环特生物 浏览次数:190

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编者按

 昼夜节律是生物在进化过程中形成的适应地球自转的生物节律之一,表现为机体在内部生物钟控制下产生的约为24 h的循环周期生物节律,协调睡眠/觉醒、体温调节、内分泌时相等活动,长期昼夜节律失调可引起代谢紊乱、胃肠疾病、神经退行性疾病等患病风险增高。水生生物斑马鱼(Danio rerio)作为典型的模式动物,已被广泛应用于昼夜节律实验研究中。

今天,我们分享2024年1月由解放军疾病预防控制中心、中国医科大学公共卫生学院研究团队发表的综述性文章《斑马鱼模型在昼夜节律研究中的应用进展》,该文详细介绍了斑马鱼生物钟的运行机制、输入系统的影响因素、生物钟基因及通路、生理性输出,总结了在昼夜节律研究中的应用及优势,并展望了未来研究发展,以期为昼夜节律调控机制研究和相关药物研发以及疾病治疗策略提供理论支持。

文章题目

斑马鱼模型在昼夜节律研究中的应用进展

杂志:《Mil Med Sci》(Vol 48,No 1)

发表时间:2024年1月

作者:宗尤佳、李雨浓、郭家彬、彭辉等

单位:解放军疾病预防控制中心、中国医科大学公共卫生学院等

01、研究背景

生物节律是生物体内生理、生化和行为活动发生自主周期性波动变化的现象,其周期可以是秒、天、月、年,如反映月节律的生殖周期,反应年节律的冬眠夏蛰等。昼夜节律则是内源性昼夜节律振荡器产生的约 24 h的生物日节律,它参与了多项生理过程的调节,如睡眠⁃觉醒周期、体温、血压、激素分泌、代谢和免疫系统功能等。

在昼夜节律内的不同时相,生理反应存在较大差异,基于此研究揭示外源性有害因素与内源性生物节律相互作用的时间毒理学,以及探索不同时段给药以获得最大疗效和最小不良反应的时间治疗学,具有重要的现实意义。

生物钟的准确性和稳定性与机体健康息息相关,长期昼夜节律失调可引起代谢紊乱,并导致胃肠疾病、Ⅱ型糖尿病等,还与精神障碍、神经退行性疾病、心脏病和癌症等疾病发生有关,所导致的身体健康问题值得广泛关注。常见的军事作业环境,如舰艇长期噪声、坑道不规则光照、密闭舱室不适温度、睡眠环境颠簸起伏及白夜班轮值频繁等,均会造成军人昼夜节律紊乱,降低军人警觉性、积极性和身体执行能力,影响战斗力输出。

在一些特殊军事作业场景,如飞行员洲际跨时区作业、战舰潜艇长远航、宇航员空间站工作生活、特种兵国际比武适应时差、地下掩体狭小空间长时战斗等,维持机体昼夜节律已成为研究保障军人健康和军事作业效能的重要课题。斑马鱼(Danio rerio)与人类基因同源性高、个体变异性小、饲养容易,在进化过程中表现出与哺乳动物相似的昼夜节律行为,越来越多的研究证明,斑马鱼可成为研究昼夜节律的模式动物。

本文主要就斑马鱼模型在昼夜节律研究中的研究进展进行论述,详细介绍了斑马鱼生物钟运行机制、输入系统影响因素、生物钟基因及通路、生理性输出,总结了其在昼夜节律研究中的优势及应用,并展望了未来研究发展,以期为昼夜节律调控机制研究、药物研发及治疗策略提供更多理论支持。

02、研究成果

1. 斑马鱼生物钟运行机制

生物钟是由生物体自身发展的一种内源性计时机制,表现为进化上高度保守的机体节律生物反应。昼夜节律的产生和维持在整体水平依赖于生物钟系统、昼夜节律输入系统和昼夜节律输出系统的协同作用,在细胞水平依赖于内源性生物钟基因网络的精密调控。昼夜节律遗传学基础来自生物钟基因的振荡表达,包括核心钟基因(Bmal1、Clock、Cry、Per)和钟控基因(Rev ⁃ erbα、Rorα、Dbp、Tef、Hlf等)。

斑马鱼生物钟的基本运行机制与哺乳动物相似,其昼夜节律调控系统由中枢和外周生物钟系统、节律输入系统和节律输出系统组成。节律输入系统感受并向中枢生物钟系统传递以光信号为代表的环境同步信号,中枢生物钟系统作为昼夜节律主起搏器通过输出系统将产生的节律信号传递至外周,并与外周器官内源性生物钟系统协同作用维持机体的生理活动。

昼夜节律的主起搏器位于特定的大脑区域,哺乳动物主要位于视交叉上核,而非哺乳脊椎动物主要位于松果体。松果体是生物体主时钟视交叉上核附属振荡器,起到昼夜节律的神经内分泌转换器的作用。斑马鱼的核心生物钟位于松果体内,它具有感光性,可接收来自视网膜输入系统的光信号,调节睡眠⁃觉醒周期、运动活动、产卵、摄食等明显的节律输出;同时它还可协调褪黑素的释放,通过对激素释放的调控进一步影响昼夜节律。

2. 输入系统影响因素

昼夜节律的输入系统由黑视蛋白、视网膜下丘脑束RHT及视交叉上核SCN组成,输入系统可感受核心授时因子 Zeitgeber —光照信号变化进而调控中枢生物钟基因的表达。

2.1 光照

人类和动物研究的证据表明,光照是影响鱼类昼夜节律的最关键因素。斑马鱼具有多种内源性昼夜节律振荡器,可通过视觉和非视觉外围光感受器直接被光刺激所启动。

斑马鱼松果体和视网膜等感光器官或组织,作为昼夜节律输入系统,可将光信息直接传递给大脑,不受其他昼夜节律振荡器的影响。在Per2和Cry1a核心钟基因启动子中存在“光响应模块”,该模块由对钟控基因的转录调控起重要作用的顺式元件 E⁃box、D⁃box等组成。光信号通过各种信号转导途径从黑视蛋白传输到生物钟基因,这些转导途径涉及作为激活或阻抑作用的E⁃box和D⁃box元件,从而对斑马鱼机体昼夜节律产生调控。

2.2 视网膜

斑马鱼视网膜与人类相似,由视锥细胞、视杆细胞和色素上皮细胞等组成,可伴随光线和(或)昼夜节律的变化而出现形态重排,形成具有节律性的视网膜运动现象。

Zang等通过视网膜电流图发现,斑马鱼的光反应恢复在晚上延迟、在早上加快,表明斑马鱼视网膜视锥视觉转导的关键调节因子处于昼夜节律控制之下。Shi等通过孕激素的地屈孕酮暴露改变了斑马鱼视网膜时钟基因的转录,结果显示 Per1b 的转录水平降低;Per1b 缺失引起视网膜多巴胺能缺乏,导致斑马鱼视觉缺陷,影响斑马鱼昼夜节律。Huang等通过光动反应测定Per2突变的斑马鱼幼鱼发现,对比敏感度和视力下降,表明视网膜生物钟响应外部光照的强弱进而调节视觉敏感度。

2.3 视蛋白

视蛋白是动物体内普遍存在的光敏蛋白,目前在斑马鱼中已发现 32种非视觉视蛋白和10种视觉视蛋白,其中多数处于时钟控制之下,表现出强大的昼夜节律。负责非成像感光的黑视蛋白基因opn4广泛表达于斑马鱼视网膜各种细胞类型中,在生物钟昼夜节律等功能调节方面起着至关重要的作用。

Dekens等通过opn4.1和 opn4xb 基因双敲除的斑马鱼模型研究发现,相较于野生型斑马鱼,基因敲除的斑马鱼清醒状态下运动活动能力下降,体内褪黑素水平升高且per2转录水平降低,表明opn4.1和opn4xb基因对调节斑马鱼昼夜节律起到关

键作用。

3. 生物钟基因及通路

3.1 分子调控机制

生物钟基因是在细胞、组织和机体水平上调节生理昼夜节律所需的基因。在分子水平上,生物钟由一系列生物钟基因相互作用形成。生物钟基因产物的表达、积累和降解的自动调节,形成自主分子振荡器。多个转录因子、核受体和协同调节因子

通过结合特殊的DNA识别序列,驱动日常周期的振荡,最终在机体上形成了生命过程的生物钟形态。

斑马鱼的生物钟基因与哺乳动物高度相似,Clock和Bmal基因充当正调节因子,Period 和Cryptochrome基因充当负调节因子。 此外 ,Nr1d1、Nr1d2、Dec1和Dec2等基因也参与了昼夜节律的调控。

3.2 核心反馈回路

斑马鱼生物钟调节中,正调节因子(Clock和Bmal)驱动下游负调节因子(Period和Cryptochrome)的表达,负调节因子进而反馈下调正调节因子,从而构成了生物钟的核心反馈回路。

Clock 和 Bmal1基因可编码基本螺旋⁃环⁃螺旋⁃PAS转录因子家族成员的蛋白质,通过与含 PAS结构域的蛋白质相互作用,CLOCK 和 BMAL1 在细胞质中形成异二聚体复合物,然后转移到细胞核并与 E⁃box 增强子序列结合,进而激活生物钟基因的转录。Period(Per1 和Per2)和Cryptochrome(Cry1和Cry2)基因的蛋白质产物通过抑制CLOCK与BMAL1的结合来降低自身的转录,从而构成自动调节反馈回路。

Clock、Bmal、Period 和 Cryptochrome 基因均在调节昼夜节律中发挥重要作用。Basti等发现,下调斑马鱼生物钟基因Bmal1的表达可影响其昼夜节律的调节。Yang 等通过杀菌剂噻呋酰胺暴露破坏了斑马鱼昼夜节律,结果显示与昼夜节律相关的正调节基因(Clock1a、Clock2、Bmal1a和Bmal2)和调节基因(Per1a、Per1b、Per2、Per3、Cry1aa、Cry1ab、Cry1ba 和 Cry1bb)的 mRNA 水平均发生显著改变,Clock1a 和生物钟蛋白水平的变化导致斑马鱼胚胎缺陷、异常行为和代谢紊乱。

3.3  Nr1d反馈回路

通过与E⁃box增强子结合,CLOCK:BMAL1异二聚体复合物激活生物钟基因 Nr1d1 的转录。Nr1d1基因编码核受体超家族 REV⁃ERBα蛋白,该蛋白与类维生素 a相关孤儿受体 ROR 一起,通过结合位于Bmal1基因启动子中的视黄酸相关孤儿受体反应元件 RORE 来抑制 Bmal1 转录,从而形成另一个节律性反馈回路。

Nr1d1作为生物钟第二个反馈回路的主要组成部分,对昼夜节律的调节起到关键作用。Wang 等使用携带 Nr1d1 启动子驱动的不稳定荧光蛋白的转基因斑马鱼,开展了单细胞水平的体内昼夜节律研究,发现 Nr1d1 随着发育过程逐渐表达出来,且Nr1d1直接受BMAL1调控并抑制Bmal1的表达,进而参与昼夜节律调控。

4. 生理性输出

昼夜节律的输出系统包括神经内分泌系统和自主神经系统两大途径,昼夜节律紊乱会导致斑马鱼出现睡眠⁃觉醒周期变化、运动活动减慢、产卵量下降和食物摄入量减少等生理性输出改变。

4.1 睡眠⁃觉醒

昼夜节律最为典型的生理性输出是睡眠⁃觉醒周期。下视丘分泌素(hypocretin,Hcrt)是斑马鱼睡眠⁃觉醒的重要调节因子,可与去甲肾上腺素、褪黑素等相互作用,调节睡眠⁃觉醒周期,Hcrt过表达会显著增加斑马鱼觉醒[29] 。Elbaz等研究发现,Hcrt神经元消融的斑马鱼幼鱼白天睡眠增加,夜间睡眠片段化。Nishimura等发现hcrt突变体(hcrt-/-)幼鱼白天睡眠⁃觉醒转换的增加,Hcrt神经元被特异性激活。

褪黑素是一种松果体激素,在恒定光照/黑暗条件下的夜间分泌,它可通过调节重要的生物钟基因的表达进一步影响斑马鱼昼夜节律,并调节睡眠⁃觉醒周期 。Yang等研究结果表明,高效植物激素6⁃苄基氨基嘌呤通过增加斑马鱼觉醒时长、减少休息时长和诱导生物钟基因表达破坏等,扰乱了斑马鱼幼鱼的节律活动;增加褪黑素则可减轻昼夜节律紊乱,对斑马鱼睡眠⁃觉醒稳定起到保护作用。Jiang等研究发现,泼尼松龙暴露可导致斑马鱼Per和Cry基因的表达上调,褪黑素分泌减少和睡眠时间缩短。

芳香胺⁃N⁃乙酰基转移酶(arylalkylamine⁃N⁃acetyltransferase,AANAT)是褪黑素生物合成过程中关键的限速酶,控制脊椎动物松果体中褪黑素产生的昼夜节律性。斑马鱼的 aanat 基因有两个亚型:aanat1和aanat2,后者是褪黑素合成的主要基因,参与调节睡眠⁃觉醒周期。Wei等研究发现,aanat2突变斑马鱼夜间活动相比野生型对照组增加了25%,整个昼夜节律相位提前,向前推进了约3.7h且周期缩短了0.9 h,昼夜节律幅度减弱。

4.2 产卵

产卵是斑马鱼具有昼夜节律特性的输出之一,产卵和繁殖行为与昼夜节律存在密切联系。产卵活动通常在黑暗周期结束后暴露在光线下的第一分钟内开始,持续约15min到1h;在恒定的光照下,产卵节律保持其昼夜节律。Adatto等研究发现,最明显的胚胎生产高峰出现在黎明时或在给予光照后即刻,扰乱昼夜节律周期会导致斑马鱼胚胎产量下降,产卵高峰推迟和下降。

4.3 运动活动

运动活动被认为是斑马鱼成鱼和幼鱼昼夜节律的代表性输出,表现为光照周期有强烈的游泳活动,黑暗周期有类似睡眠的行为。

Audira 等研究发现,与黑暗周期相比,斑马鱼光照周期平均速度和快速移动时间相对较高,而水平蜿蜒和冻结/运动时间比相对较低。Yang等通过不同化学物质暴露研究斑马鱼行为的昼夜节律,结果表明斑马鱼在光照期间的游泳行为能力高于黑暗期间 。Luchtenburg 等对斑马鱼幼鱼进行了视觉运动反应测试发现,黑暗时期斑马鱼的游泳速度增加,诱导了类似焦虑的行为;当灯再次打开时,斑马鱼运动迅速恢复到基础水平,表明斑马鱼的运动活动具有典型的昼夜节律性。

4.4 摄食

斑马鱼的摄食行为也体现出昼夜性节律。研究人员通过构建斑马鱼自我饲喂系统发现,斑马鱼具有明显的夜间进食节奏,进食需求集中在黑暗阶段的最后4h,且这种节奏是内源性的,在自由游动的条件下持续存在。

Sbragaglia 等通过开展斑马鱼大小尺寸选择性死亡实验研究鱼类进化,结果显示clock1a、per1b和arntl1a等生物钟基因的表达在不同尺寸死亡组发生改变,昼夜振荡表达存在明显差异,但所有处理组斑马鱼在黑暗的最后几个小时均存在自主进食活动,表明了自我摄食活动的内在昼夜节律调节的强大适应性和稳固性。

5. 用于昼夜节律研究的优势

与小鼠、果蝇等昼夜节律研究模式动物相比,斑马鱼已被广泛证明拥有大量已识别的生物钟基因和有据可查的昼夜节律活动模式,在昼夜节律实验开展中具有众多优势:

第一,与人类相同的昼夜节律时相。小鼠虽是常用的昼夜节律实验动物,但其主要睡眠阶段在白天,与人类睡眠时相相反;斑马鱼主要在光周期活动、暗周期睡眠,与人类睡眠时相相符;

第二,更丰富的生物钟基因。与果蝇和小鼠相比,斑马鱼由于存在第三次全基因组复制,体内存在丰富的生物钟基因拷贝,如正调节因子Clock(1a、1b、2)Bmal(1a、1b、2),负调节因子Per(1a、1b、2、3)、Cry(1ab、1bb、1b)等;

第三,更稳定可靠的调控系统。斑马鱼外周生物钟可直接受光控制,不需要类似于哺乳动物视交叉上核的“主振荡器”来协调整个身体的昼夜节律,昼夜节律网络比

哺乳动物更加分散可靠;此外,小鼠近交系中缺乏合成褪黑素所需要的酶,使用这些小鼠品系的昼夜节律研究可能会低估松果体和褪黑素本身的作用;

第四,更易操作和更低的研究成本。与小鼠、猕猴等相比,斑马鱼与人类基因组高度相似,体积小,易操作,养殖成本低,孵化快,研究周期短,透明的胚胎更易开展发育研究;转基因技术成熟,易构建足够数目的具有统一遗传背景的模型;与灌胃、注射等给药方式相比,斑马鱼经水体直接暴露可减少试验操作手法的差异和动物的不适感,都使斑马鱼成为研究昼夜节律和睡眠过程的一种理想模式动物。

6. 在昼夜节律研究中的应用

鉴于斑马鱼在昼夜节律相关研究中的独特的优势,其胚胎、幼鱼被广泛应用于昼夜节律相关的新型环境污染物毒性评价和药物安全性评估。

Cao等通过四溴二苯醚 BDE⁃47暴露于斑马鱼幼鱼发现,夜间opn4基因表达下降,白天opn4a和opn4.1表达增加,黑视蛋白系统发生扰乱,导致昼夜节律紊乱。Luan 等通过微塑料暴露引起了斑马鱼Bmal1b表达降低、Clock1a表达增加,而Per1b表达随着微塑料暴露量增加而减弱,Cry1a表达水平降低,扰乱了斑马鱼幼鱼的昼夜节律。Zheng等通过镉暴露扰乱了斑马鱼的昼夜节律信号,结果显示Nr1d1、Nr1d2a、Nr1d2b基因表达下调,Nr1d1表现出强烈的昼夜节律表达模式。Aranda⁃Martínez等使用神经毒素 MPTP 诱导斑马鱼胚胎形成帕金森症,导致褪黑素昼夜节律消失,斑马鱼幼鱼夜间活动增加。Chen 等通过建立高通量与自动化处理相结合的昼夜行为筛选方法,发现神经活性药物米氮平和杀菌剂噻虫嗪增加了斑马鱼幼鱼昼夜节律长度和幅度。

03、展望

生物钟是由生物体自身发展的一目前应用斑马鱼开展昼夜节律实验还主要集中在单独行为监测、生物钟基因及蛋白表达检测等,对具体调节昼夜节律的分子机制研究还不够深入;同时,斑马鱼基因敲除还面临脱靶高和潜在免疫反应等问题,相关的实验模型及方法仍需完善。

未来,基于斑马鱼开展昼夜节律的研究将进一步受益于新技术的推广应用,如大规模组学分析(转录组学、蛋白质组学和代谢组学)、转基因脊椎动物(基因敲降或敲除、特异荧光标记)、计算生物学(生物大数据和计算毒理分析)和先进的实验室方法(移动追踪平台、新型体积成像、自动化解决方案)等,甚至是多交叉学科方法的整合。这些都将推动斑马鱼应用到昼夜节律相关机制的深入研究,为相关药物研发和疾病治疗策略提供更多理论支持。

作为健康美丽产业CRO服务开拓者与引领者、斑马鱼生物技术的全球领导者,环特生物搭建了“斑马鱼、类器官、哺乳动物、人体”四位一体的综合技术服务体系,开展健康美丽CRO服务、科研服务、智慧实验室搭建三大业务。目前,环特已建立200多种斑马鱼模型、人诱导多能干细胞及多种癌种的类器官培养平台,欢迎有需要的读者垂询!

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