利用斑马鱼模型评价防治卵巢早衰功效

【评价原理】

卵巢早衰（POI）指女性在40岁前即出现卵巢功能耗竭，全球育龄期女性患病率约1–2%。POI不仅使自然受孕率骤降至<5%，还因长期雌激素缺乏导致骨质疏松和椎体骨折风险增加3倍，并加速动脉粥样硬化使冠心病提前5–10年；同时伴发潮热、抑郁和认知下降，最终使全因死亡率较正常人群上升约70%。

与人类一样，斑马鱼卵巢和睾丸由性腺原基形成，该性腺原基（双潜能原基）具有双向分化潜能。斑马鱼卵巢发育和功能的相关基因和人具有同源性，且基因功能保守。斑马鱼的卵巢主要由性腺组织和周围的卵母细胞卵泡组成，成熟卵母细胞卵泡的发育阶段主要分为初级卵母细胞、皮质滤泡卵母细胞、早期卵母细胞和成熟卵母细胞。

环磷酰胺是一种烷基化化疗剂，通过诱导卵母细胞DNA双链断裂，并激活ROS-线粒体凋亡通路，不可逆地耗竭原始卵泡，从而触发卵巢早衰。

我们评价防治卵巢早衰功效有多个指标：1.卵巢病理切片；2.体重、卵巢重量；3.促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）活力，雌二醇（E2）含量；4.qPCR检测相关基因表达量：雌激素受体基因esr1、esr2a和esr2b。

【实验方案】

我们将受测试斑马鱼分成三组，分别是正常对照组、模型对照组和供试品组。其中正常对照组未摄入环磷酰胺，模型对照组与服用供试品组都摄入了等量的环磷酰胺（环磷酰胺通过溶解到养鱼用水中的方式摄入到斑马鱼体内）。服用供试品组在摄入环磷酰胺之前摄入供试品。

服用一段时间供试品后，我们收集斑马鱼样本，采集卵巢组织，制作病理切片观察卵巢的病理结构变化。

【结果展示】

图1. 斑马鱼卵巢结构示例图

a.初级生长期卵母细胞：体积小而颜色深，呈小三角形或长方形；b.皮质滤泡期卵母细胞：由一层颗粒细胞包围，细胞边缘出现皮质泡并延伸至细胞核周围；c.卵黄生长期卵母细胞：开始形成卵黄物质，包括小的卵黄滴及体积较大的卵黄球。成熟期卵母细胞由于卵黄物质持续增加，卵质面积减少，卵黄滴相互融合，卵核偏移，时常观察不到细胞核；d.排卵后卵泡：成熟卵母细胞排卵后，卵泡变为空囊，卵泡周围挤压变形。

图2. 斑马鱼卵巢病理切片表型图

(S，saccule（球囊）；U，utricle（椭圆囊）)

从病理切片可以看到，正常对照组斑马鱼正处于性成熟阶段，卵巢内可见a-d各个发育阶段、形态正常的卵母细胞，说明卵巢储备功能正常，其中皮质滤泡期卵母细胞（b，黑色箭头）偏多，提示正在为卵黄和卵黄蛋白的形成做准备。环磷酰胺处理斑马鱼后，斑马鱼卵巢卵母细胞数量减少，大多为挤压变形的卵黄生长期卵母细胞（c，绿色箭头），其卵泡变为空囊、内部卵黄物质大量减少、卵黄膜与透明带解体，提示卵巢储备功能下降、卵母细胞衰老，出现卵巢早衰。供试品组卵巢内可见各个发育阶段的正常卵母细胞，皮质滤泡期卵母细胞数量多、卵黄生长期卵母细胞内卵黄物质饱满，细胞结构清晰，与正常对照组相似，具有防治卵巢早衰功效。

【评价结论】

1.经过每组10尾斑马鱼的对比实验，服用或注射供试品组的斑马鱼卵巢结构较模型对照组有所改善，各级卵母细胞数量较模型对照组增多。

2.本实验证实供试品具有防治卵巢早衰功效。

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