利用细胞评价供试品舒缓功效

项目一：TNF-α和 IL-1α的表达量

【评价原理】

暴露于生活环境中的皮肤，接触到有毒有害物质后可能引起一定程度的皮肤炎症，出现皮肤红肿、瘙痒等现象。化妆品对皮肤的刺激表型主要表现为皮肤炎症，炎症早期主要表现为毛细血管扩张、通透性亢进和水肿。各种炎症因子在急性和慢性炎症发生过程中扮演着关键角色，如白细胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。本实验目的主要是利用永生化角质形成细胞（HaCaT）和 UVB 建立模型，将供试品作用于 HaCaT 后检测 TNF-α和 IL-1α的表达量，可以评估受试物舒缓的作用。

实验一：MTT 法检测样品对 HaCaT 的细胞毒性实验

1）细胞接种：接种细胞于 96 孔板内（1 × 10^4个/孔），于 37 ℃，5% CO2中培养 24 h。

2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育 24 h。

3）孵育结束后向每孔中加入 MTT 溶液，继续培养 4 h。

4）去培养液，加入 DMSO 溶液，振荡混匀，测定 490 nm 处吸光度值。

OD490：490 nm 处的吸光度值

实验二：样品对 UVB 辐射后 HaCaT 的  TNF-α和 IL-1α 基因表达

1） 细胞接种：将 HaCaT 以 6 × 10^5个/孔接种于 6 孔板，于培养箱（37℃、5%CO2）中培养12 h，分别设置正常对照组（0 mJ/cm2+0 mM 样品）、模型对照组（80 mJ/cm2+0 mM 样品）低浓度组（80 mJ/cm2+AmM 样品）、中浓度组（80 mJ/cm2+B mM 样品）、高浓度组（80 mJ/cm2 + CmM 样品）。

2） UVB 造模：UVB 辐射前 HaCaT 用 D’Hanks 洗 3 遍，在孔中加入 1 ml D’Hanks，使之浸没细胞，正常对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组，对需要辐射的组分别进行 UVB造模；

3） 给药：各试验组中分别加入含有不同浓度样品的 DMEM 培养基中继续培养 24 h；

4）培养结束后，进行细胞收样，提取各实验组总 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR 检测β-actin和目的基因的基因表达。

5）用β-actin 作为基因表达的内参，计算目的基因的 RNA 相对表达量。

【评价指标】NF-κB 基因表达

【评价结论】与模型对照组相比，实验组 TNF-α和 IL-1α基因表达均且具有显著性下调且呈现剂量相关性（P＜0.05），初步证明样品具有抗炎功效。

【参考文献】

[1] C. A. Feghali and T. M. Wright, “Cytokines in acute and chronic inflammation,” Frontiers inBioscience, vol. 2, pp. d12–d26, 1997.

[2] J. K. Kundu and Y. J. Surh, “Inflammation: gearing the journey to cancer,” MutationResearch, vol. 659, no. 1-2, pp. 15–30, 2008. 

[3] C. A. Dinarello, “The paradox of pro-inflammatory cytokines in cancer,” Cancer and Metastasis Reviews, vol. 25, no. 3, pp. 307–313, 2006. 

[4] Magcwebeba T, Riedel S, Swanevelder S, Bouic P, Swart P, Gelderblom W. Interleukin-1αInduction in Human Keratinocytes (HaCaT): An In Vitro Model for Chemoprevention in Skin. JSkin Cancer. 2012:393681.

项目二：TRPV1 基因表达

【评价原理】

炎 TRPV1 受体是一种伤害感受器，能够被化学物质（辣椒素）、伤害性热刺激和酸化等多种因素激活。TRPV1 广泛存在与 C 类感觉神经传入纤维及角质形成细胞中。TRPV1 受体被激活后，单价和二价阳离子（主要为 Ca2+）进入细胞，触发动作电位，传入高级中枢系统，产生灼烧痛感。因此，通过受试物作用后，阻断或抑制 TRPV1 受体蛋白的表达，有助于缓解灼烧痛感，达到舒缓的目的。因此，可以通过检测样品处理后角质形成细胞中TRPV1 基因表达量，以此维度指标初步判定样品是否具有舒缓功效。

【实验方案】

实验一：MTT 法检测样品对 HaCaT 的细胞毒性实验

1）细胞接种：接种细胞于 96 孔板内（1 × 10^4个/孔），于 37 ℃，5% CO2中培养 24 h。

2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育 24 h。

3）孵育结束后向每孔中加入 MTT 溶液，继续培养 4 h。

4）去培养液，加入 DMSO 溶液，振荡混匀，测定 490 nm 处吸光度值。

OD490：490 nm 处的吸光度值

实验二：样品对辣椒素刺激后 HaCaT 的 TRPV1 基因表达

1） 细胞接种：将 HaCaT 以 6 × 10^5个/孔接种于 6 孔板，于培养箱（37℃、5%CO2）中培养12 h，分别设置正常对照组（（0 mM CAP+0 mM 样品）、模型对照组（X mM CAP+0 mM 样品）、低浓度组（X mM CAP+A mM 样品）、中浓度组（X mM CAP+B mM 样品）、高浓度组（X mM CAP + C mM 样品）。

2） 诱导及给药：弃掉 6 孔板中的培养液，开展给药操作。根据以上药物分组加入含有受试物和 CAP 贮备液的培养液，每孔 1 mL。给药完毕后将 24 孔板放置在培养箱中（37℃、5%CO2）培养 24h±2h。3）孵育结束后，D-Hanks 轻柔冲洗细胞一次或两次，正常对照组加入新鲜培养基，样品组加入含相应浓度的样品新鲜培养基，37 ℃，5% CO2 培养 24 h。

4）培养结束后，进行细胞收样，提取各实验组总 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR 检测β-actin和目的基因的基因表达。

5）用β-actin 作为基因表达的内参，计算目的基因的 RNA 相对表达量。

【评价指标】TRPV1 基因表达

【评价结论】

与模型对照组相比，实验组 TRPV1 基因表达均且具有显著性下调且呈现剂量相关性（P＜0.05），初步证明样品具有抗炎功效。

【参考文献】

[1] 李文海,刘青,刘欣会,等.辣椒素受体在银屑病皮损中的表达及其意义[J].临床皮肤科杂志 2013年 42 卷 9 期, 518-521 页, ISTIC PKU CSCD, 2013:北京大学人民医院研究与发展基金. 

[2]Ge Yiman,葛一漫,Hu Yimei,等.马齿苋挥发油对辣椒素诱导的细胞内瘙痒相关通路的影响[C]//四川省医学会第十六次检验医学学术会议.2016.

项目三：NF-κB 基因表达

【评价原理】

炎症是一种生理反应，它保护身体免受各种伤害，如物理伤害、病原体、有毒化学物质暴露和紫外线照射。各种炎症因子在急性和慢性炎症发生过程中扮演着关键角色，其中，NF-κB 被认为是炎症反应的主要调节因子。大量数据表明，NF-κB 活化与炎症之间存在正相关，例如，一氧化氮合成酶，炎性细胞因子，如 IL-6、IL-8 和 TNF-α；趋化因子 CCL2和 CXCL8 等上调。因此，可以通过检测样品处理后角质形成细胞中 NF-κB 基因表达量，以此维度指标初步判定样品是否具有抗炎功效。

【实验方案】

实验一：MTT 法检测样品对 HaCaT 的细胞毒性实验

1）细胞接种：接种细胞于 96 孔板内（1 × 10^4个/孔），于 37 ℃，5% CO2中培养 24 h。

2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育 24 h。

3）孵育结束后向每孔中加入 MTT 溶液，继续培养 4 h。

4）去培养液，加入 DMSO 溶液，振荡混匀，测定 490 nm 处吸光度值。

OD490：490 nm 处的吸光度值

实验二：样品对 UVB 辐射后 HaCaT 的 NF-κB 基因表达

1） 细胞接种：将 HaCaT 以 6 × 10^5个/孔接种于 6 孔板，于培养箱（37℃、5%CO2）中培养12 h，分别设置正常对照组（0 mJ/cm2+0 mM 样品）、模型对照组（80 mJ/cm2+0 mM 样品）低浓度组（80 mJ/cm2+AmM 样品）、中浓度组（80 mJ/cm2+B mM 样品）、高浓度组（80 mJ/cm2 + CmM 样品）。

2） UVB 造模：UVB 辐射前 HaCaT 用 D’Hanks 洗 3 遍，在孔中加入 1 ml D’Hanks，使之浸没细胞，正常对照组用锡纸包住置暗处。针对试验分组，对需要辐射的组分别进行 UVB造模；

3） 给药：各试验组中分别加入含有不同浓度样品的 DMEM 培养基中继续培养 24 h；

4）培养结束后，进行细胞收样，提取各实验组总 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR 检测β-actin和目的基因的基因表达。

5）用β-actin 作为基因表达的内参，计算目的基因的 RNA 相对表达量。

【评价指标】NF-κB 基因表达

【评价结论】与模型对照组相比，实验组 NF-κB 基因表达均且具有显著性下调且呈现剂量相关性（P＜0.05），初步证明样品具有抗炎功效。

【参考文献】

[1] Gao J, Chen F, Fang H, Mi J, Qi Q, Yang M. Daphnetin inhibits proliferation and inflammatory response in human HaCaT keratinocytes and ameliorates imiquimod-induced psoriasis-like skin lesion in mice. Biol Res. 2020,20;53(1):48. 

[2] Suter MM, Schulze K, Bergman W, Welle M, Roosje P, Müller EJ. The keratinocyte in epidermal renewal and defence. Vet Dermatol. 2009,20(5-6):515-32.

项目四：iNOS基因表达

【评价原理】

NO 是一种活性高、不稳定的小分子化合物，它对维护正常的细胞功能至关重要。在生理状态下，NO 不仅是重要的神经递质，还可以调节血管舒缩功能、减少血栓形成、清除自由基等。但在病理情况下，NO 是介导免疫过程和炎症反应的重要炎性因子。作为合成 NO的关键限速酶，一氧化氮合酶（nitrie oxidessynthase，NOS）一般分为两类，即结构型 cNOS( constitutive nitrie oxides synthase)和诱导型 iNOS( inducible nitric oxides synthase) 。其中，iNOS 主要位于巨噬细胞、白细胞和炎症区上皮细胞。与 cNOS 相比，健康状态时 iNOS 表达缺乏，只有在细胞被促炎细胞因子和/或细菌脂多糖刺激后才被诱导表达。诱导后的 iNOS可产生高于 cNOS 产生量 1000 倍的 NO，活性可以维持数小时到数天。因此，本研究拟通过 LPS 体外诱导炎症 Raw264.7 模型,检测样品处理后 iNOS 的基因表达水平，以此维度评价样品的抗炎舒缓功效。

【实验方案】

实验一：MTT 法检测样品对 Raw246.7 的细胞毒性实验

1）细胞接种：接种细胞于 96 孔板内（1 × 10^4个/孔），于 37 ℃，5% CO2中培养 24 h。

2）给药：样品组加入相应浓度的含样品的培养基，正常对照组更换为新鲜培养基，空白组加入空白培养基，37 ℃，5% CO2孵育 24 h。

3）孵育结束后向每孔中加入 MTT 溶液，继续培养 4 h。

4）去培养液，加入 DMSO 溶液，振荡混匀，测定 490 nm 处吸光度值。

OD490：490 nm 处的吸光度值

实验二：样品对 LPS 造模后的 Raw246.7 的 INOS 的表达情况

1）细胞接种：将 Raw246.7 以 6 × 10^5个/孔接种于 6 孔板，于培养箱（37℃、5%CO2）中培养 12 h，分别设置对照组（0 μg/L+0 mM 样品）、低浓度组（0.5 μg/L LPS+A mM 样品）、中浓度组（0.5 μg/L LPS+B mM 样品）、高浓度组（0.5 μg/L LPS+ C mM 样品）

2）LPS 造模＋给药：针对试验分组，对需要造模及给药组分别进行一定终浓度 LPS 和药物处理 24 h±2 h；

3）细胞收集：培养结束后，进行细胞收样，提取各实验组总 RNA，合成 cDNA，利用 q-PCR检测β-actin 和目的基因的基因表达。

4）用β-actin 作为基因表达的内参，计算目的基因的 RNA 相对表达量。

【评价指标】iNOS 基因表达

【评价结论】与模型对照组相比，实验组 iNOS 基因表达均且具有显著性下调且呈现剂量相关性（P＜0.05），初步证明样品具有抗炎舒缓功效。